酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)在藥殘檢測(cè)中的不足及解決方法

郭淑萍，徐周喬

（深圳市鹽田區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，廣東深圳 518081）

食品安全問題已經(jīng)成為全球關(guān)注的焦點(diǎn)問題之一。近年來,獸藥殘留致使食物中毒的報(bào)道屢見報(bào)端,嚴(yán)重?fù)p害了人們的健康，而且造成了意想不到的經(jīng)濟(jì)損失和巨大的政治影響。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法主要采用高壓液相色譜（HPLC）、氣相色譜一質(zhì)譜法（GC－MS）等分析法檢測(cè)獸藥殘留，需要昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)人員，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、成本高，難以在基層推廣。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、樣品容量大、儀器化程度和分析成本低的優(yōu)點(diǎn)，已成為目前畜產(chǎn)品藥物殘留檢測(cè)中使用最普遍的方法之一，幾乎所有重要的畜產(chǎn)品藥殘檢測(cè)都已建立或試圖建立ELISA，如“瘦肉精”、萊克多巴胺、磺胺類、沙丁胺醇等。盡管酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)有操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，但在實(shí)踐中很容易出現(xiàn)各種各樣的問題，影響因素較多，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果等缺點(diǎn)?，F(xiàn)將常出現(xiàn)問題的可能原因和解決方法以及影響因素作如下探討。

一、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)原理

ELISA方法的基本原理是酶分子與抗體或抗體分子共價(jià)結(jié)合，此種結(jié)合不會(huì)改變抗體的免疫學(xué)特性，也不影響酶的生物學(xué)活性。此種酶標(biāo)記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無色的還原型變成有色的氧化型，出現(xiàn)顏色反應(yīng)。因此，可通過底物的顏色反應(yīng)來判定有無相應(yīng)的免疫反應(yīng)，顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原的量呈正比。此種顯色反應(yīng)可通過ELISA檢測(cè)儀進(jìn)行定量測(cè)定，這樣就將酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來，使ELISA方法成為一種既特異又敏感的檢測(cè)方法。

二、常出現(xiàn)問題的可能原因及解決方法

目前酶聯(lián)免疫法檢測(cè)用試劑盒種類繁多，有國(guó)外進(jìn)口的，有國(guó)內(nèi)自行研制生產(chǎn)的，如鹽酸克侖特羅的檢測(cè)用試劑盒就有德國(guó)拜爾、美國(guó)IDS、英國(guó)朗道、北京望爾、杭州迪恩等。如何在眾多的品牌中選擇既能滿足檢測(cè)要求又價(jià)格低廉的試劑盒是一個(gè)問題。在實(shí)際檢測(cè)中可以根據(jù)最低檢測(cè)限、回收率、交叉反應(yīng)率。標(biāo)準(zhǔn)曲線圖譜及數(shù)據(jù)，進(jìn)行選擇。一般進(jìn)口試劑盒性能穩(wěn)定性比國(guó)內(nèi)試劑盒好。但不管進(jìn)口或者國(guó)內(nèi)試劑盒難免會(huì)造成假陰性或假陽性，常出現(xiàn)問題的可能原因及解決方法有其共性。

1.顯色結(jié)束仍沒有顏色或吸光度值偏低。出現(xiàn)這種情況的可能的原因主要有幾個(gè)方面，一是試劑盒保存運(yùn)輸不當(dāng)；二是使用前酶標(biāo)板已完全干燥；三是酶標(biāo)抗原未加或稀釋度過低或加錯(cuò)；四是溫度過低或試劑盒沒有回溫；五是檢測(cè)試劑盒中的酶標(biāo)抗原失效；六是試劑盒超過有效期。

解決方法：試劑盒在運(yùn)轉(zhuǎn)過程中，要放在加冰袋的保溫盒中，盡量縮短運(yùn)輸時(shí)間，實(shí)驗(yàn)室保存試劑盒放在4℃～8℃冰箱中存放，不可放在室內(nèi)。使用前檢查酶標(biāo)板，將已干孔丟棄；酶標(biāo)抗原必須嚴(yán)格按照說明書中酶標(biāo)抗原的稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋并準(zhǔn)確加樣；酶標(biāo)抗原失效可與供應(yīng)商聯(lián)系，進(jìn)行更換；在接收試劑時(shí)要驗(yàn)明有效期，如試劑盒有效期太短，不能在有效期內(nèi)用完則要求供貨商換貨。

2.顯色結(jié)束整塊板吸光度值都很高。出現(xiàn)這種情況有兩方面原因，一是酶標(biāo)抗原污染了盒內(nèi)的其他試劑，二是未進(jìn)行洗版操作，直接加顯色劑。此種情況可以更換新批號(hào)試劑盒，并嚴(yán)格按照說明書中的洗板操作步驟進(jìn)行稀釋。

3.標(biāo)準(zhǔn)曲線形態(tài)不好，吸光度值偏高。主要是酶標(biāo)抗原的稀釋倍數(shù)偏低，反應(yīng)溫度過高?？乖♂寱r(shí)必須按照說明書稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋，反應(yīng)溫度在控制合理范圍內(nèi)。

4.標(biāo)準(zhǔn)曲線形態(tài)不好，吸光度值偏低。主要是因?yàn)榧用笜?biāo)抗原前未進(jìn)行洗板操作，酶標(biāo)抗原的稀釋倍數(shù)偏高，反應(yīng)溫度過低。同樣要嚴(yán)格按照洗版步驟和抗原稀釋倍數(shù)操作，控制反應(yīng)溫度。

5.平行性不好。主要是加樣及試劑量不準(zhǔn)確，洗版后孔干燥時(shí)間過長(zhǎng)，酶標(biāo)抗原加入時(shí)有誤差。要求定期校準(zhǔn)移液器，移液器與移液頭要配套，使其吻合緊密，確保準(zhǔn)確加入足量標(biāo)本和試劑。操作時(shí)務(wù)必保持實(shí)驗(yàn)的連貫性，試驗(yàn)的保溫溫度、時(shí)間要一致，洗滌要徹底，不要手工洗板與洗板機(jī)洗板互換。酶標(biāo)抗原稀釋前注意混合均勻，使用多道移液器進(jìn)行加入操作。

6.樣品的高陽性率。主要是樣品處理去脂肪或蛋白不徹底，實(shí)驗(yàn)時(shí)樣品要按要求進(jìn)行前處理。

7.樣品的吸光度值高于零標(biāo)準(zhǔn)孔。引起的因素主要是樣品中蛋白或脂肪含量、pH值、離子強(qiáng)度等。如果嚴(yán)格按照操作方法進(jìn)行操作，此現(xiàn)象應(yīng)作為陰性處理。

8.回收率不理想。如果樣品渾濁，添加標(biāo)準(zhǔn)時(shí)濃度低，添加體積大都會(huì)造成回收率不理想。做添加回收實(shí)驗(yàn)時(shí)要選感覺明亮的本底，添加少量高濃度標(biāo)準(zhǔn)品。

9.整板均不顯色。整板均不顯色，包括陽性對(duì)照孔也不顯色。有下列3種情況。

（1）制造商工藝流程出現(xiàn)問題，如包被過程中抗原或抗體未固相化在載體上。

（2）試劑盒保存不當(dāng)，或運(yùn)輸過程中溫度過高，使酶蛋白變性，失去生物活性。

（3）更常見的原因是，試劑配制有誤，或操作不當(dāng)所致。如終止液誤當(dāng)洗滌液稀釋后當(dāng)洗滌液使用，終止液誤作底物配制液配制底物。操作過程中，未加酶標(biāo)抗體或抗原和未加顯色液而誤認(rèn)為已加入。

對(duì)整板均不顯色，首先應(yīng)核實(shí)是何種原因引起。要求配制試劑時(shí)仔細(xì)認(rèn)真，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。此問題是可以完全避免的。

10.整板均顯色。出現(xiàn)整板均顯色的實(shí)驗(yàn)室結(jié)果，主要有以下幾種原因。

（1）水質(zhì)被重金屬離子污染。

（2）洗滌不充分，殘留酶標(biāo)抗原或抗體，或樣品中存在其他干擾成分，未被洗掉。

（3）酶標(biāo)抗原或抗體加量過多，使按規(guī)程洗滌仍達(dá)不到洗滌目的。

（4）移液頭重復(fù)使用而未清洗干凈。解決上述問題的措施是，使用新鮮蒸餾水或去離子水配制試劑；試驗(yàn)前校準(zhǔn)移液器，準(zhǔn)確加入酶標(biāo)抗原或抗體的量；充分洗滌，不使酶標(biāo)記物由于洗滌不充分而殘留；移液頭盡可能一次性使用，否則就要對(duì)其徹底清洗后再用。另外，對(duì)整板均顯色要特別注意二點(diǎn)，一是雖然整板均顯色，但陽性對(duì)照孔比平時(shí)顯色更深；二是陽性對(duì)照孔本應(yīng)不顯色而顯色，這對(duì)查找整板均顯色的原因很有幫助。

三、實(shí)驗(yàn)室影響因素

除在實(shí)驗(yàn)過程出現(xiàn)的問題，實(shí)驗(yàn)室整個(gè)環(huán)境過程都會(huì)影響到檢驗(yàn)結(jié)果，主要有以下幾個(gè)因素。

1.實(shí)驗(yàn)室操作人員的素質(zhì)因素。實(shí)驗(yàn)室人員應(yīng)具備一個(gè)良好的思想素質(zhì)，有一定文化素質(zhì)和技術(shù)素質(zhì)，能熟練掌握本專業(yè)的基本理論和基本技術(shù)，認(rèn)真學(xué)習(xí)新理論新知識(shí)，努力提高自己的業(yè)務(wù)水平，創(chuàng)造一個(gè)能夠勝任本職工作的技術(shù)平臺(tái)。在工作中，有條不紊、冷靜沉著的處理有關(guān)事務(wù)。

2.樣本處理因素。實(shí)驗(yàn)室人員收到樣本后應(yīng)認(rèn)真查對(duì)，對(duì)不符合檢測(cè)要求的要退回，合格標(biāo)本要及時(shí)進(jìn)行處理檢測(cè)。對(duì)不能及時(shí)檢測(cè)的標(biāo)本要妥善保存于4℃冰箱，貼好待檢標(biāo)簽，做好記錄。從冰箱取出的標(biāo)本要預(yù)溫至室溫，對(duì)冰凍的樣品要融化好，并充分混勻再用。

3.操作過程的影響因素。

（1）操作前應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)的物理參數(shù)有充分的了解，如環(huán)境溫度(保持在18℃～25℃)、反應(yīng)孵育溫度和孵育時(shí)間、洗滌的次數(shù)等，要先查看水育箱溫度，是否符合要求。

（2）正確使用加樣器。加樣器應(yīng)垂直加入標(biāo)本或試劑，避免刮擦包被板底部。加樣過程中避免液體外濺，殘留在反應(yīng)孔壁上，加樣器吸頭要清洗干凈，避免污染，加樣次序要與說明書一致，否則可導(dǎo)致結(jié)果錯(cuò)誤，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差。

（3）手工洗板加洗液時(shí)沖擊力不要太大，洗滌次數(shù)不要超過說明書推薦的洗滌次數(shù)，洗液在反應(yīng)孔內(nèi)滯留的時(shí)間不宜太長(zhǎng)。不要使洗液在孔間竄流，造成孔間污染，導(dǎo)致假陰性或假陽性。

（4）要保證加液量一致。

（5）顯色液量不可過多。加樣的工作環(huán)境不能處于陽光直射的環(huán)境下，加顯色系統(tǒng)后要避光反應(yīng)，顯色液量不能過多，以免顯色過強(qiáng)。

4.試劑的影響因素。應(yīng)選用有質(zhì)量保證試劑盒。試劑應(yīng)妥善保存于4℃冰箱內(nèi)，在使用時(shí)先平衡至室溫，不同批號(hào)的試劑組分不宜交叉使用。試劑開啟后要在一周內(nèi)用完，剩余的試劑下次用時(shí)應(yīng)先檢查是否變質(zhì)，顯色劑如被污染變色將造成全部顯色，導(dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)果。過期的試劑不宜再用，若別無選擇，應(yīng)做好雙份質(zhì)控品的監(jiān)測(cè)，確保結(jié)果的可靠性。

5.采取措施，避免差錯(cuò)事故的發(fā)生。創(chuàng)造一個(gè)良好的工作環(huán)境，建立完善的質(zhì)量保證體系，將質(zhì)控貫穿到整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程，包括待檢者的準(zhǔn)備、標(biāo)本的采集與處理、操作過程、檢驗(yàn)結(jié)果的審核、結(jié)果的登記與保存、報(bào)告單的發(fā)放等一系列的制度，用制度管人，明確責(zé)任，錯(cuò)誤的結(jié)果還是能夠避免發(fā)生的。

綜上所述，在使有用ELISA試驗(yàn)中，會(huì)由于各種情況影響試驗(yàn)結(jié)果。但只要按說明書規(guī)范操作，規(guī)范實(shí)驗(yàn)程序，出現(xiàn)問題后仔細(xì)分析，認(rèn)真查找其中原因，并加以有效地防范和解決，就能得到準(zhǔn)確的試驗(yàn)結(jié)果。為遏制獸藥殘留提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。