端粒酶與腫瘤的診斷和治療

楊仕明,陳 陵,余松濤,房殿春

(第三軍醫(yī)大學(xué)全軍消化病研究所,重慶,400038)

2009年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予了加州大學(xué)舊金山分校的Elizabeth Blackburn,約翰霍普金斯大學(xué)的Carol Greider,以及哈佛醫(yī)學(xué)院的Jack Szostak。諾貝爾獎(jiǎng)主頁(yè)上介紹他們獲獎(jiǎng)的原因是揭示了“染色體是如何被端粒和端粒酶保護(hù)的”。

其實(shí),早在上個(gè)世紀(jì) 30年代,Barbara Mc-Clintock女士(因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)玉米的轉(zhuǎn)座子獲得諾獎(jiǎng))以及Hermann J.Muller(因發(fā)現(xiàn)X射線的誘變作用獲得諾獎(jiǎng))注意到,自然斷裂的染色體很容易端-端融合,而正常染色體的自然末端,為什么不容易相互融合呢?合理的推測(cè)是,染色體的自然末端不同于非正常的DNA斷裂末端,它應(yīng)該有一個(gè)特殊的結(jié)構(gòu)來(lái)避免染色體之間的相互融合,這個(gè)染色體的末端結(jié)構(gòu)被稱之為端粒(telomere)。染色體端粒的假說(shuō)最后被Blackburn所證實(shí)[1-3],作為Blackburn的學(xué)生,Greider證實(shí)了端粒酶的存在[4],而Szostak應(yīng)用Blackburn的端粒成分,成功構(gòu)建了人工染色體[2],從而使DNA的大片段克隆成為可能,并為人類基因組測(cè)序的工作立下了汗馬功勞。

由于端粒及其相關(guān)蛋白的陸續(xù)被發(fā)現(xiàn),以及端粒酶及其相關(guān)亞單位的克隆,現(xiàn)在人們已明白,在體細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中,每有絲分裂一次,端粒長(zhǎng)度就會(huì)丟失一部分,當(dāng)染色體端粒長(zhǎng)度不足以維持細(xì)胞功能時(shí),細(xì)胞便會(huì)退出細(xì)胞周期而衰老死亡,這也就是染色體端粒長(zhǎng)度可以作為細(xì)胞有絲分裂鐘的原因。端粒的作用在于維持染色體結(jié)構(gòu)的完整性,防止染色體末端被降解,而端粒酶的作用在于維持染色體端粒長(zhǎng)度。正常體細(xì)胞由于端粒酶沒(méi)有活化,染色體端粒長(zhǎng)度隨著細(xì)胞有絲分裂而逐漸縮短,最后衰老死亡;腫瘤細(xì)胞由于端粒酶的活化,使腫瘤細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度可以維持一種動(dòng)態(tài)平衡,腫瘤細(xì)胞才得以無(wú)限制地增殖。當(dāng)然,85%以上的腫瘤組織或細(xì)胞端粒酶是陽(yáng)性的,只有極少數(shù)的腫瘤細(xì)胞端粒酶為陰性,這類腫瘤細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度是通過(guò)ALT途徑來(lái)維持[5-6],具體的機(jī)制現(xiàn)在仍不明確。

過(guò)去一直認(rèn)為腫瘤端粒酶的活化是腫瘤細(xì)胞無(wú)限增殖有關(guān),但臨床研究發(fā)現(xiàn),端粒酶的活化還與腫瘤患者的不良預(yù)后亦密切相關(guān)。那么,腫瘤細(xì)胞的端粒酶活化是否參與了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移的過(guò)程呢?為此,我們將端粒酶催化活化亞單位(hTERT)轉(zhuǎn)染到端粒酶陰性的腫瘤細(xì)胞中,結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了 hTERT的U2OS骨肉瘤細(xì)胞(U2OS/hTERT)不僅體外增殖能力增強(qiáng),體外穿膜能力亦明顯增強(qiáng),進(jìn)一步將不同的轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)裸鼠尾靜脈注射到裸鼠體內(nèi),采用動(dòng)物熒光成像系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)U2OS/hTERT細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移能力較轉(zhuǎn)染了空載體的 U2OS細(xì)胞(U2OS/EGFP)明顯增強(qiáng),提示端粒酶的活化可以明顯增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。那么,端粒酶活化增進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制是什么,作者采用生物力學(xué)方法,研究了不同轉(zhuǎn)染細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附能力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)hTERT轉(zhuǎn)染可以明顯增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附能力[7]。粘附分子家族在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中具有重要作用,hTERT通過(guò)何種途徑增強(qiáng)、活化了哪一類的粘附分子,從而增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附作用,促進(jìn)了腫瘤的轉(zhuǎn)移,這是作者下一步需要研究的重點(diǎn)。以上研究表明,端粒酶的活化不僅是腫瘤發(fā)生的早期事件,與腫瘤細(xì)胞的無(wú)限增殖有關(guān),而且還參與了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。因此,端粒酶及其hTERT亞單位可以作為腫瘤診斷和治療的良好靶標(biāo)。

在腫瘤的診斷方面,由于端粒酶在85%以上的惡性腫瘤中表達(dá),監(jiān)測(cè)組織或體液中端粒酶的活性有助于腫瘤的診斷。有學(xué)者檢測(cè)胸腹水中或尿液脫落細(xì)胞端粒酶的活性,發(fā)現(xiàn)惡性胸腹水中端粒酶的活性明顯高于良性患者[8],而尿液中端粒酶活性的檢測(cè)有助于發(fā)現(xiàn)泌尿系統(tǒng)的惡性腫瘤的診斷以及術(shù)后復(fù)發(fā)的判斷[9-10]。近年來(lái)隨著分子影像技術(shù)的進(jìn)步,利用端粒酶hTERT亞單位在腫瘤組織中表達(dá)的相對(duì)特異性,通過(guò)hTERT啟動(dòng)子啟動(dòng)下游報(bào)告基因的表達(dá),從而實(shí)現(xiàn)活體實(shí)時(shí)腫瘤顯像成為研究的熱點(diǎn)[11]。為此,我們通過(guò)全基因合成文獻(xiàn)報(bào)道的優(yōu)化型的hTERT啟動(dòng)子[12],將其克隆至慢病毒載體中,其下游克隆EGFP全長(zhǎng)cDNA作為報(bào)告子,利用活體光學(xué)成像技術(shù)研究了hTERT靶向性活體光學(xué)成像技術(shù)在腫瘤實(shí)時(shí)診斷中的作用,發(fā)現(xiàn)含有優(yōu)化型hTERT啟動(dòng)子的慢病毒體外感染細(xì)胞后,能夠在端粒酶陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異表達(dá)GFP,在體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),感染含優(yōu)化型hTERT啟動(dòng)子的慢病毒之后,端粒酶陽(yáng)性活體腫瘤能夠被特異性的實(shí)時(shí)觀察到,并且腫瘤內(nèi)的GFP信號(hào)在存活裸鼠體內(nèi)維持30天,隨腫瘤增大而增強(qiáng)。該研究提示優(yōu)化后hTERT啟動(dòng)子對(duì)報(bào)告基因的調(diào)控具有嚴(yán)格的端粒酶特異性。結(jié)合小動(dòng)物活體光學(xué)成像系統(tǒng),荷瘤裸鼠內(nèi)的端粒酶陽(yáng)性腫瘤能夠被無(wú)創(chuàng)的、實(shí)時(shí)的、特異性的成像,為腫瘤的特異性早期診斷提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)[13]。

在腫瘤的治療方面,端粒酶及其hTERT亞單位不僅可以作為腫瘤基因治療的靶點(diǎn),還可以作為一種腫瘤共有抗原用于腫瘤的免疫治療。已有大量的研究表明,無(wú)論是反義技術(shù)、RNA干擾技術(shù)均可以下調(diào)腫瘤組織端粒酶的活性,從而達(dá)到抑制腫瘤的目的[14-16],第二種基因治療方法是采用hTERT啟動(dòng)子的端粒酶靶向性,將自殺基因克隆到hTERT啟動(dòng)子的下游,從而達(dá)到定向殺傷端粒酶陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的目的[17]。

近年來(lái),免疫治療作為繼手術(shù)、化療、放療之后的第4種腫瘤治療模式由于其特異性好,毒副作用小,越來(lái)越受到學(xué)者的重視?；跇?shù)突狀細(xì)胞(DC)的腫瘤免疫治療因其毒副作用小、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)成為腫瘤免疫治療研究的熱點(diǎn)。將腫瘤相關(guān)抗原(TAA)與DC相結(jié)合,通過(guò)DC對(duì)腫瘤抗原的高效提呈作用激發(fā)機(jī)體的特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)是腫瘤免疫治療的一個(gè)熱門課題。目前多采用TAA致敏的DC免疫機(jī)體,以產(chǎn)生抗原特異性的抗腫瘤反應(yīng)。雖然TAA致敏的方法有多種,但目前發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)抗原大多具有組織特異性,如MARR-1只針對(duì)黑色素瘤、PSA只針對(duì)前列腺癌、CEA只針對(duì)消化道腫瘤或肺癌、AFP只針對(duì)肝癌等,以這些腫瘤相關(guān)抗原來(lái)進(jìn)行免疫治療,只能對(duì)相應(yīng)的腫瘤起作用,而對(duì)不表達(dá)該抗原的其他來(lái)源的腫瘤不具有殺傷作用。因此,尋找腫瘤特異性的共有抗原成為腫瘤免疫治療關(guān)鍵問(wèn)題。理想的腫瘤共有抗原(universal tumor-associated antigen)應(yīng)符合[18]:①在絕大多數(shù)腫瘤組織中表達(dá)從而可以廣泛應(yīng)用;②只表達(dá)于腫瘤細(xì)胞以避免自身免疫反應(yīng);③不表達(dá)于正常成熟組織以避免免疫耐受;④在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有不可替代的作用,以避免抗原缺失;⑤能誘導(dǎo)足夠強(qiáng)度的免疫反應(yīng)并導(dǎo)致腫瘤消退;⑥同時(shí)包含有MHCⅠ和MHCⅡ類分子,從而可誘導(dǎo)CD4+和CD8+T細(xì)胞反應(yīng)。端粒酶由于主要在腫瘤組織和部分癌前組織中表達(dá)外,在正常體細(xì)胞內(nèi)少有表達(dá),如果腫瘤細(xì)胞為逃避免疫監(jiān)視而下調(diào)端粒酶的表達(dá),其本身就足以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移,因此,端粒酶可以作為一種廣譜的腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)抗原用于中晚期腫瘤的免疫治療。作者將hTERT全長(zhǎng)基因序列克隆到腺病毒載體內(nèi),經(jīng)293細(xì)胞重組包將后,將病毒顆粒負(fù)載DC,可以誘導(dǎo)產(chǎn)生hTERT特異性的CT L細(xì)胞,對(duì)端粒酶陽(yáng)性且HLA相匹配的腫瘤細(xì)胞具有殺傷效應(yīng),對(duì)端粒酶陰性或HLA不匹配的腫瘤細(xì)胞不具有殺傷效應(yīng),更為可喜的是,hTERT特異性CTL細(xì)胞對(duì)表達(dá)少量端粒酶的自體淋巴細(xì)胞和 DC不具有殺傷效應(yīng),提示hTERT負(fù)載的DC疫苗具有端粒酶特異性且受HLA的限制,這種疫苗對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷具有高效、特異、安全的特點(diǎn),為端粒酶疫苗的抗腫瘤效應(yīng)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)[19-20]。

目前的研究表明,CD8+T細(xì)胞所識(shí)別的靶抗原需先經(jīng)抗原遞呈后,以“抗原肽-MHCⅠ類分子”復(fù)合物的形式呈現(xiàn)于抗原遞呈細(xì)胞(APC)或靶細(xì)胞表面,才能被CD8+T細(xì)胞所識(shí)別。相應(yīng)的與主要組織相容性復(fù)合物(MHC)Ⅰ類分子結(jié)合的抗原肽即為CTL表位(cytotoxic T lymphocyte epitopes)[21]。隨著對(duì)免疫應(yīng)答分子機(jī)制的深入研究,人們已認(rèn)識(shí)到機(jī)體的免疫細(xì)胞并不是一一對(duì)應(yīng)于各種各樣的病原體或天然抗原的整體分子,而是針對(duì)各種各樣抗原分子的抗原表位(epitope),蛋白質(zhì)抗原是通過(guò)其表位來(lái)體現(xiàn)其免疫特異性。因此,在表位水平上對(duì)抗原性的認(rèn)識(shí)已促成這樣一種趨勢(shì):基于抗原分子的免疫干預(yù)手段已不再停留在病原體或天然抗原的整體水平,而開(kāi)始向 CT L表位水平過(guò)渡[22-23]。由于hTERT全長(zhǎng)cDNA可以誘導(dǎo)產(chǎn)生hTERT特異性的CTL反應(yīng),那么在hTERT全長(zhǎng)氨基酸序列中一定存在能夠誘發(fā)這種CT L反應(yīng)的抗原表位。事實(shí)上,受不同Ⅰ類分子限制的hTERT的CTL表位陸續(xù)被發(fā)現(xiàn),部分已進(jìn)行了臨床實(shí)驗(yàn),證明有一定的抗腫瘤活性[24]。

總之,由于端粒酶及其hTERT亞單位在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要作用,以及它在腫瘤組織中表達(dá)的相對(duì)特異性,端粒酶在腫瘤的診斷及治療中將可能發(fā)揮重要的作用。

[1]Blackburn E H,and Gall J G.A tandemly repeated sequence at the termini of the extrachromosomal ribosomal RNA genes in Tetrahymena[J].J Mol Biol,1978,120:33.

[2]Szostak J W and Blackburn E H.Cloning yeast telomeres on linear plasmid vectors[J].Cell,1982,29:245.

[3]Shampay J,Szostak J W,Blackburn E H.DNA sequences of telomeres maintained in yeast[J].Nature,1984,310:154.

[4]Greider C W and Blackburn E H.Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts[J].Cell,1985,43:405.

[5]Bryan T M,Englezou A,Dalla-Pozza L,et al.Evidence for an alternative mechanism for maintaining telomere length in human tumors and tumor-derived cell lines[J].Nat Med,1997,3(11):1271.

[6]Bryan T M,Englezou A,Gupta J,et al.Telomere elongation in immortal human cells without detectable telomerase activity[J].EMBO J,1995,14(17):4240.

[7]陳 陵,余松濤,梁光萍,等.端粒酶hTERT促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移及其機(jī)制研究[J].實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志,2010,14(3):13.

[8]楊幼林,馬志斌,徐洪雨.端粒酶檢測(cè)在良惡性腹水鑒別診斷中的價(jià)值[J].中華內(nèi)科雜志,2005,44(10):745.

[9]Bravaccini S,Casadio V,Amadori D,et al.The current role of telomerase in the diagnosis of bladder cancer[J].Indian J Urol,2009,25(1):40.

[10]Herman M P,Svatek R S,Lotan Y,et al.Urine-based biomarkers for the early detection and surveillance of nonmuscle invasive bladder cancer[J].Minerva Urol Nefrol,2008,60(4):217.

[11]Kishimoto1 H,Kojima1 T,Watanabe1 Y,et al.In vivo imaging of lymph node metastasis with telomerase-specific replication-selective adenovirus[J].Nat Med,2006,12(10):1213.

[12]蘇長(zhǎng)青,王星華,崔貞福,等.腫瘤端粒酶靶向腺病毒載體的表達(dá)活性[J].實(shí)用癌癥雜志,2004,19(5):449.

[13]余松濤,楊應(yīng)斌,史春夢(mèng),等.端粒酶hTERT亞單位啟動(dòng)子靶向性慢病毒對(duì)腫瘤活體實(shí)時(shí)顯像的實(shí)驗(yàn)研究[J].實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志,2010,14(3):4.

[14]Yang S M,Fang D C,Yang J L,et al.Antisense human telomerase reverse transcriptase could partially reverse malignant phenotypes of gastric carcinoma cell line in vitro[J].Eur J Cancer Prev,2008,17(3):209.

[15]張汝鋼,房殿春,羅元輝,等.人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶干擾對(duì)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的影響[J].中華肝臟病雜志,2006,14(6):435.

[16]Jeong J S,Lee S W,Hong S H,et al.Antitumor effects of systemically delivered adenovirus harboring trans-splicing ribozyme in intrahepatic colon cancer mouse model[J].Clin Cancer Res,2008,14(1):281.

[17]Painter R G,Lanson N A Jr,Jin Z,et al.Conditional expression of a suicide gene by the telomere reverse transcriptase promoter for potential post-therapeutic deletion of tumorigenesis[J].Cancer Sci,2005,96(9):607.

[18]Vonderheide R H.Prospects and challenges of building a cancer vaccine targeting telomerase[J].Biochimie,2008,90(1):173.

[19]Chen L,Liang G P,Tang X D,et al.In vitro anti-tumor immune response induced by dendritic cells transfected with hTERT recombinant adenovirus[J].Biochem Biophy Res Commun,2006,351:927.

[20]Chen L,Tang X D,Yu S T,et al.Induction of anti-tumor immunity by dendritic cells transduced with hT ERT recombinant adenovirus in mice[J].J Pathol,2009,217:685.

[21]Kobayashi H,Celis E.Peptide epitope identification for tumor-reactive CD4 T cells[J].Curr Opin Immunol,2008,20(2):221.

[22]Lundberg K,Roos A K,Pavlenko M,et al.A modified epitope identified for generation and monitoring of PSA-specific T cells in patients on early phases of PSA-based immunotherapeutic protocols[J].Vaccine,2009,27(10):1557.

[23]Cavallo F,Forni G.Recent advances in cancer immunotherapy with an emphasis on vaccines[J].Expert Rev Vaccines,2009,8(1):25.

[24]Vonderheide R H.Telomerase as a universal tumor-associated antigen for cancer.Immunotherapy[J].Oncogene,2002,21,674.