現(xiàn)代微生物技術(shù)在乳品工業(yè)中的應(yīng)用

■ 曾慶坤 李 玲 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所

據(jù)考證，人類利用微生物來制作乳制品已經(jīng)有4000 多年的歷史。人們?cè)趯?shí)踐中開始了解微生物的生長(zhǎng)特性及規(guī)律，并逐步掌握了利用微生物的機(jī)能、代謝產(chǎn)物等來加工產(chǎn)品的技術(shù)。19世紀(jì)以來，隨著微生物學(xué)的不斷發(fā)展，微生物技術(shù)在乳品工業(yè)中得到了比較廣泛的應(yīng)用。20世紀(jì)下半葉以來，生物技術(shù)發(fā)展異常迅猛，從而使微生物的研究從細(xì)胞水平發(fā)展到分子水平，以轉(zhuǎn)基因、基因芯片、PCR技術(shù)等為基礎(chǔ)的現(xiàn)代微生物技術(shù)在乳品工業(yè)中逐步得到了應(yīng)用，促進(jìn)了乳制品加工和質(zhì)量控制技術(shù)的發(fā)展。

1 現(xiàn)代微生物技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀

1.1 微生物的快速檢測(cè)技術(shù)[1]

隨著食品工業(yè)的快速發(fā)展，以及消費(fèi)者對(duì)食品安全日益的關(guān)注和重視，傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)方法已難以滿足人們的需求，現(xiàn)實(shí)社會(huì)迫切需要一些靈敏度更高，特異性更強(qiáng)，更加簡(jiǎn)便快捷的食品安全檢測(cè)技術(shù)和方法。此外，隨著我國(guó)食品對(duì)外貿(mào)易的不斷擴(kuò)大，建立和完善與之相適應(yīng)的食品微生物安全檢測(cè)技術(shù)和體系也迫在眉睫。因此，近年來不少機(jī)構(gòu)和學(xué)者都致力于快速檢測(cè)技術(shù)和方法的研究，并已開發(fā)了一些新的快速檢測(cè)技術(shù)，使傳統(tǒng)的培養(yǎng)水平逐步向分子水平邁進(jìn)。

1.1.1 免疫學(xué)技術(shù)

免疫學(xué)技術(shù)是利用抗原和抗體的特異性反應(yīng)原理，通過病原物刺激使機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，即產(chǎn)生免疫球蛋白（抗體）的方法，再輔以免疫放大技術(shù)來鑒別細(xì)菌。免疫方法的優(yōu)點(diǎn)是樣品在進(jìn)行選擇性增菌后，不需分離即可采用免疫技術(shù)進(jìn)行篩選。由于免疫法的靈敏度較高，檢出量低，檢測(cè)時(shí)間短，因此，在食品微生物檢測(cè)中應(yīng)用較廣。通常根據(jù)檢測(cè)技術(shù)的不同可分為免疫擴(kuò)散反應(yīng)、凝集反應(yīng)、免疫熒光反應(yīng)、酶免疫等測(cè)定方法。

1.1.2 核酸探針技術(shù)

核酸探針是指帶有標(biāo)記的特異DNA片斷，根據(jù)堿基互補(bǔ)原則，核酸探針能特異性地與目標(biāo)DNA結(jié)合，然后再用特定的方法測(cè)定標(biāo)記物，從而達(dá)到檢出目標(biāo)微生物的目的。探針標(biāo)記方式分為放射性標(biāo)記、非放射性標(biāo)記。放射性標(biāo)記的核酸探針的特異性非常強(qiáng)，檢測(cè)病原微生物速度要比常規(guī)方法快很多。但目前用得較多的是用生物素——抗生物素蛋白系統(tǒng)標(biāo)記的非放射性核酸探針，該探針已在沙門氏菌、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌及乙型肝炎病毒的檢測(cè)中得到很好的應(yīng)用。

1.1.3 PCR技術(shù)

雖然基因探針技術(shù)檢測(cè)速度較快，但由于靈敏度不夠高，需要對(duì)樣品進(jìn)行一定時(shí)間的培養(yǎng)，而且每一種探針只能檢測(cè)一種菌，這影響了基因探針技術(shù)的進(jìn)一步應(yīng)用。1983年，Millus和 Cetus發(fā)明了擴(kuò)增DNA或增加樣品中特殊核苷酸片段數(shù)量的方法：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，即PCR技術(shù)，這在一定程度上克服了基因探針?biāo)嬖诘膯栴}。該方法通過加熱使雙鏈DNA裂解成2 條單鏈，成為引物和DNA聚合酶的模板；然后降低溫度，使寡聚核苷酸引物與DNA分子上的互補(bǔ)序列退火；然后升高溫度，酶促延伸引物與DNA配對(duì)合成模板。如此重復(fù)循環(huán)上述加熱變性雙鏈、引物退火和鏈延伸的過程，每次循環(huán)都會(huì)將靶 DNA擴(kuò)增1 倍，典型擴(kuò)增經(jīng)過40 次循環(huán)能引起100 萬(wàn)倍的擴(kuò)增。最后用凝膠電泳、比色測(cè)定及紫外核酸檢測(cè)儀等觀察擴(kuò)增結(jié)果。

PCR技術(shù)是一項(xiàng)全新的快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)，有的準(zhǔn)確率高達(dá)100%，如用同位素標(biāo)記2 種基因（Lac Z和Lam B）的探針做PCR反應(yīng)，檢測(cè)水源中的E.Coli。因此，PCR技術(shù)在細(xì)菌診斷方面具有廣闊的應(yīng)用前景。目前已有自動(dòng)化PCR檢測(cè)試劑盒，使用非常方便。如美國(guó)杜邦快立康公司的BAX+病原菌檢測(cè)系統(tǒng)，可檢測(cè)沙門氏菌、大腸桿菌0157、單增李斯特菌等。

1.1.4 生物芯片技術(shù)[2]

生物芯片技術(shù)是隨著“人類基因組計(jì)劃”（human genome project，HGP）的進(jìn)展而發(fā)展起來的。生物芯片技術(shù)包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、細(xì)胞芯片、組織芯片，以及元件型微陣列芯片、通道型微陣列芯片、生物傳感芯片等新型生物芯片。

基因芯片（gene chip）技術(shù)是20世紀(jì)90年代興起的前沿生物技術(shù)?；蛐酒步蠨NA芯片、DNA微陣列（DNA microarray）、寡核苷酸陣列（oligonucleotide array），是指采用原位合成（in situsynthesis）或顯微打印手段，將數(shù)以萬(wàn)計(jì)的DNA探針固化于支持物表面上，產(chǎn)生二維DNA探針陣列，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過檢測(cè)雜交信號(hào)來實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品快速、并行、高效地檢測(cè)或醫(yī)學(xué)診斷。由于常用硅芯片作為固相支持物，且在制備過程運(yùn)用了計(jì)算機(jī)芯片的制備技術(shù)，所以稱之為基因芯片技術(shù)。由于基因芯片的信息量大，操作簡(jiǎn)單，可靠性好，重復(fù)性強(qiáng)，以及可以反復(fù)利用等，因此，被廣泛應(yīng)用于食品檢測(cè)中有害微生物和轉(zhuǎn)基因成分的鑒別。與傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)、生化鑒定、血清分型等檢測(cè)方法相比，基因芯片技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：一是基因芯片可以實(shí)現(xiàn)微生物的高通量和并行檢測(cè)，一次實(shí)驗(yàn)即可得出全部結(jié)果；二是操作簡(jiǎn)便快速，整個(gè)檢測(cè)只需4 h就可以得出結(jié)果，而傳統(tǒng)方法一般需4～7 天；三是特異性強(qiáng)，靈敏度高。

1.2 航空育種技術(shù)[3]

傳統(tǒng)上，微生物育種通常采用誘變育種方法，誘變劑主要分物理和化學(xué)兩大類。物理誘變劑有紫外線、X射線、γ射線（Co60）等?；瘜W(xué)誘變劑有亞硝酸、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯和亞硝基胍等。

航天育種是利用微生物經(jīng)大劑量、高強(qiáng)度宇宙射線輻射及微重力場(chǎng)作用后發(fā)生變異來進(jìn)行誘變育種的新技術(shù)。該方法是將微生物細(xì)胞懸浮液送入高空，停留一定時(shí)間后返回地球進(jìn)行培養(yǎng)；然后采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄌ蕴?fù)變異菌株，選出一些性狀優(yōu)良的正變異菌株；再根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)品特點(diǎn)復(fù)篩出生命力旺盛，生產(chǎn)速度快，代謝產(chǎn)物得率高，以及品質(zhì)優(yōu)良的菌株，并排除生理變異與遺傳變異，就可得到經(jīng)航天培育的優(yōu)良微生物菌種。航天育種具有無污染，操作方便的優(yōu)點(diǎn)，效果非常明顯。

我國(guó)從20世紀(jì)90年代開始通過高空氣球搭載，將微生物送入太空進(jìn)行誘變育種，并成功返回。隨著我國(guó)航天技術(shù)的發(fā)展，未來我國(guó)食品微生物誘變育種將會(huì)取得更大的成效。

1.3 轉(zhuǎn)基因技術(shù)[4]

基因工程技術(shù)是現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)展的基礎(chǔ)，微生物是應(yīng)用基因工程技術(shù)最基本且重要的—環(huán)，因此，轉(zhuǎn)基因微生物的構(gòu)筑、開發(fā)是所有轉(zhuǎn)基因食品研究的基礎(chǔ)。目前，一些利用轉(zhuǎn)基因微生物生產(chǎn)的酶（如凝乳酶）已在食品工業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用。這些酶具有產(chǎn)量高，品質(zhì)高，穩(wěn)定性好和價(jià)格低等優(yōu)點(diǎn)?；蚬こ棠槊傅难芯渴加?970年，目的在于改善干酪的生產(chǎn)方法與提高凝乳酶性能，1998年第1 個(gè)轉(zhuǎn)基因微生物生產(chǎn)的凝乳酶產(chǎn)品面市，開始在干酪生產(chǎn)中試用?；蚬こ棠槊府a(chǎn)品的純度高，且含 100%凝乳酶 （小牛胃萃取液僅含70%～90%凝乳酶），所制造的干酪在產(chǎn)品得率與品質(zhì)上均優(yōu)于傳統(tǒng)小牛胃凝乳酶制造的干酪。美國(guó)已有超過70%的干酪是用轉(zhuǎn)基因微生物生產(chǎn)的凝乳酶制造的。

2 現(xiàn)代微生物技術(shù)在乳品工業(yè)中的應(yīng)用

2.1 生奶中微生物的檢測(cè)和鑒定

在生奶的收購(gòu)、加工和產(chǎn)品質(zhì)量控制等過程中，微生物檢測(cè)是一項(xiàng)必不可少的同時(shí)又是比較繁雜的工作。此外，由于傳統(tǒng)微生物檢測(cè)技術(shù)耗時(shí)比較長(zhǎng)，給乳制品生產(chǎn)管理和產(chǎn)品品質(zhì)控制帶來了許多困難和問題。利用免疫學(xué)和基因探針、基因芯片等技術(shù)可實(shí)現(xiàn)乳制品中微生物尤其是致病微生物的快速檢測(cè)，原本需要幾天的檢測(cè)時(shí)間，可縮短至幾小時(shí)，這樣可使產(chǎn)品在出廠前完成檢測(cè)工作，確保產(chǎn)品的質(zhì)量安全。

此外，利用基因技術(shù)和PCR技術(shù)可對(duì)微生物進(jìn)行鑒定，如乳酸菌和轉(zhuǎn)基因微生物的鑒定，這些方法具有速度快，準(zhǔn)確性高，穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，目前已得到很好的應(yīng)用。

2.2 酶制劑的生產(chǎn)

凝乳酶、乳糖酶、脂肪酶及其它蛋白酶、肽酶等是乳品工業(yè)常用的酶制劑。凝乳酶主要用于干酪生產(chǎn)，以往主要使用小牛皺胃酶，然而，提取小牛皺胃酶需要宰殺大量的犢牛，其產(chǎn)量受到一定的限制，難以滿足干酪生產(chǎn)不斷增長(zhǎng)的需要。經(jīng)過不斷的探索，人們發(fā)現(xiàn)一些微生物產(chǎn)生的酶可應(yīng)用于干酪生產(chǎn)，有的微生物還能生產(chǎn)純凝乳酶。用乳糖酶處理牛奶可使牛奶中的乳糖水解為半乳糖和葡萄糖，解決乳糖不耐癥及乳糖在冰淇淋中砂狀結(jié)晶析出的問題。在乳制品加工時(shí)，添加適量的脂肪酶可增加干酪和黃油的香味，這樣既可節(jié)約黃油的用量，還可以提高產(chǎn)品的風(fēng)味。在干酪中添加酶，還可縮短干酪的成熟時(shí)間。

采用微生物基因工程技術(shù)可生產(chǎn)大量乳品工業(yè)用酶，如將牛凝乳酶原生產(chǎn)基因植入大腸桿菌，用發(fā)酵法生產(chǎn)真正的凝乳酶，該技術(shù)已獲成功，轉(zhuǎn)基因凝乳酶已大量應(yīng)用于干酪生產(chǎn)。隨著蛋白質(zhì)工程技術(shù)的快速發(fā)展，不久的將來會(huì)有越來越多更穩(wěn)定，特異性與催化效率更佳的，利用轉(zhuǎn)基因微生物生產(chǎn)的酶應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。

2.3 益生菌的改良

益生菌是一類可以在人或其它寄主體內(nèi)（主要是腸道）定植，有利于人體或寄主健康的微生物。常見的益生菌主要有乳酸菌、雙歧桿菌等，這些益生菌的攝入和在人體腸道內(nèi)定植，不僅有利于改善腸道內(nèi)上皮細(xì)胞和黏膜細(xì)胞的粘附性，而且通過分泌一些抗菌物質(zhì)抑制有害菌群的生長(zhǎng)，從而起到保健作用。

通過益生菌的基因組學(xué)研究，可掌握益生菌功能特性的控制基因，從而通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得優(yōu)良性狀的益生菌菌株。此外，還可對(duì)微生物的代謝途徑進(jìn)行調(diào)控，從而達(dá)到精確改造益生菌的細(xì)胞特性的目的。例如，經(jīng)過改良的乳酸菌，可以通過一個(gè)相對(duì)簡(jiǎn)單的代謝途徑，把乳糖轉(zhuǎn)化為乳酸，從而適應(yīng)高乳糖的生長(zhǎng)環(huán)境。另外，還可通過改造代謝途徑來生產(chǎn)不同風(fēng)味的酸奶，這對(duì)于進(jìn)行市場(chǎng)的差異性劃分是非常有益的[5]。

2.4 功能活性產(chǎn)品的生產(chǎn)

研究表明，乳蛋白經(jīng)水解后可產(chǎn)生一些多肽類物質(zhì)，這類物質(zhì)具有增強(qiáng)免疫功能，抗凝血，抗過敏，降血壓和降低膽固醇等功效[6]。利用不同的蛋白酶可將乳蛋白分解成特定的、具有不同功能特性的多肽。利用微生物發(fā)酵法，即通過微生物生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的胞內(nèi)、胞外酶的作用，也可將乳蛋白分解成具有一定生物活性的多肽物質(zhì)[7]，而通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)可得到特異性強(qiáng)的高產(chǎn)菌株。

2.5 細(xì)菌素的應(yīng)用

乳酸鏈球菌肽（Nisin）作為一種多肽類物質(zhì)，可抑制一些細(xì)菌的生長(zhǎng)，同時(shí)，這種物質(zhì)添加于食品中不會(huì)被其中的微生物分解，對(duì)人體無毒害作用。但乳酸鏈球菌肽對(duì)蛋白水解酶 （胰酶、唾液酶、消化酶等）很敏感，人食用后在消化道內(nèi)很快被水解成氨基酸，并且不改變腸道內(nèi)的正常菌落，也不會(huì)與常用的其它抗生素（如青霉素、鏈霉素等）產(chǎn)生交叉抗性，是一種安全的防腐劑，可以用作乳制品的保鮮劑。采用基因重組技術(shù)構(gòu)建高產(chǎn)、廣譜抗性菌株，可以獲得抗菌效果更好的天然防腐劑。

2.6 合成香味物質(zhì)，改善產(chǎn)品的風(fēng)味

許多微生物如細(xì)菌、真菌、酵母菌在生長(zhǎng)過程中都能夠產(chǎn)生香氣物質(zhì)，利用微生物這一特性可以合成許多風(fēng)味物質(zhì)。如合成含N的雜環(huán)類吡嗪化合物，可產(chǎn)生菠蘿、馬鈴薯、爆米花、堅(jiān)果味；內(nèi)酯化合物具有水果味、可可味、奶酪味及堅(jiān)果味；萜烯類化合物主要有香茅醇、香味醇、里那醇等；細(xì)菌菌株還能夠降解丁香醛產(chǎn)生香蘭素，可用作產(chǎn)品的增香劑[8]。用微生物合成法生產(chǎn)香味物質(zhì)具有生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，成本低，產(chǎn)品品種多以及風(fēng)味柔和等特點(diǎn)，這些香味物質(zhì)可用于開發(fā)不同風(fēng)味的乳制品，以滿足不同消費(fèi)者的需要。

3 前景展望

隨著生物技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，現(xiàn)代微生物技術(shù)將會(huì)在乳制品衛(wèi)生質(zhì)量檢測(cè)，益生菌的改良和選育，新型發(fā)酵乳制品的開發(fā)，酶及添加劑的生產(chǎn)，以及產(chǎn)品質(zhì)量控制等各方面得到廣泛的應(yīng)用，這對(duì)于促進(jìn)乳品工業(yè)科技進(jìn)步，開發(fā)新型乳制品，提高行業(yè)工作效能，降低運(yùn)行成本，有效控制產(chǎn)品質(zhì)量和保障乳品質(zhì)量安全等都具有非常重要的作用。

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