葡萄糖對(duì)INS-1細(xì)胞活性氧及PTEN表達(dá)的調(diào)控

肖 玲 周湘蘭 周連華 楊志紅 胡仁明 劉珊林 黎丹鳳 何建秋

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院內(nèi)分泌科,上海 200540;2.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院內(nèi)分泌科,上海 200040;3.復(fù)旦大學(xué)自由基調(diào)控與應(yīng)用研究中心,上海 200032)

糖尿病是由于靶組織細(xì)胞對(duì)胰島素敏感性降低合并胰島β細(xì)胞功能不足引起,以慢性高血糖為特征的多因素疾病。其中胰島β細(xì)胞數(shù)量及功能不足是導(dǎo)致糖尿病發(fā)生的最根本原因,因此胰島β細(xì)胞功能調(diào)控是糖尿病研究的重要課題。

影響胰島β細(xì)胞數(shù)量及功能的因素主要有高糖、高脂、遺傳、年齡、胰高血糖素樣肽I(GLP-1)、胰淀素、胰島素抵抗。其中大多數(shù)因素均可導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激增加,包括活性氧(reactive oxygen species,ROS)的增多。ROS化學(xué)性質(zhì)活潑,可直接攻擊核酸、蛋白等生物分子,影響機(jī)體功能。低濃度ROS可以作為信號(hào)分子參與許多生理過程,如生理濃度的ROS作為信號(hào)分子之一參與葡萄糖刺激胰島β細(xì)胞分泌胰島素(GSIS)的信號(hào)通路[1-3]。ROS作為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子,其下游信號(hào)途徑有多種[4],包括PTEN(phosphatase with sequence homology to tensin)及其他的線粒體通透轉(zhuǎn)運(yùn)孔道(PTPs)。目前,尚不清楚ROS是否對(duì)胰島β細(xì)胞PTEN具有調(diào)節(jié)作用,ROS是否通過調(diào)控第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶與張力蛋白同源物基因(PTEN)而參與葡萄糖刺激的胰島素分泌(GSIS)信號(hào)通路。本研究通過不同濃度糖及H2O2對(duì)胰島細(xì)胞系(INS-1)干預(yù),探討ROS調(diào)控胰島素分泌機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 材料 INS-1細(xì)胞由復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院內(nèi)分泌研究所提供。RMPI1640培養(yǎng)基為GIBCO公司產(chǎn)品,胎牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品;大鼠胰島素酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒為Mercodia公司產(chǎn)品;細(xì)胞ROS檢測(cè)試劑盒為碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為TOYOBO產(chǎn)品;2×Taq PCR MasterMix為 Tiangen公司產(chǎn)品;30%H2O2溶液為分析純產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 INS-1細(xì)胞培養(yǎng)與干預(yù) INS-1細(xì)胞(第75代),置20%FBS1640培養(yǎng)液培養(yǎng),細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。傳至4～5代后,以1×106/孔接種在6孔板,培養(yǎng)貼壁后,棄培養(yǎng)液,用PBS洗2次,各孔分別加入終濃度為 0、3、7、11和20 mmol?L-1的無菌葡萄糖和終濃度為 0、1 μmol?L-1、2 μmol?L-1、4 μmol?L-1、6 μmol?L-1和 8μmol?L-1的 H2O2,在無血清培養(yǎng)液孵育30 min,收集細(xì)胞檢測(cè) ROS,抽提 RNA,留取培養(yǎng)液測(cè)胰島素分泌。

1.2.2 INS-1細(xì)胞分泌胰島素的檢測(cè) 按ELISA試劑盒說明書操作。

1.2.3 INS-1細(xì)胞內(nèi)ROS的檢測(cè) DCFH-DA熒光法,按試劑盒操作。

1.2.4 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法測(cè)INS-1細(xì)胞PTENmRNA的表達(dá) 分別收集高糖和H 2 O2干預(yù)后的INS-1細(xì)胞,提取總 RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。PTEN 引物序列:F:5′-TGGCTAAGTGAAGACGACAATC-3′;R:5′-CGCACGCTCTATACTACAAATG-3′;擴(kuò)增長(zhǎng)度:597 bp;變性溫度94℃,退火溫度為52.7℃,延伸溫度72℃,25個(gè)循環(huán) 。β-actin 引物序列:F:5′-TGGCTAAGTGAAGACGACAATC-3′ R: 5′-CGCACGCT CTATACTACAAATG-3′擴(kuò)增長(zhǎng)度:500 bp;變性溫度94℃,退火溫度為52.7℃,延伸溫度72℃,25個(gè)循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 13.0軟件,采用單因素方差分析和兩兩比較的Dunnett方法分析數(shù)據(jù),檢測(cè)數(shù)據(jù)用(ˉx±s)表示,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 葡萄糖對(duì)INS-1細(xì)胞胰島素分泌、ROS的影響 隨著葡萄糖干預(yù)濃度升高,INS-1細(xì)胞分泌胰島素和胞內(nèi)ROS水平逐漸增高。經(jīng)Dunnett法檢驗(yàn),對(duì)照組與干預(yù)組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,經(jīng)干預(yù)后胰島素分泌及胞內(nèi)ROS水平均較對(duì)照組明顯升高(表1)。

2.2 H2 O2對(duì)INS-1細(xì)胞胰島素分泌、ROS的影響隨著H2O2干預(yù)濃度升高,INS-1細(xì)胞分泌胰島素和胞內(nèi)ROS水平逐漸增高。經(jīng)Dunnett法檢驗(yàn),對(duì)照組與干預(yù)組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2),經(jīng)干預(yù)后胰島素分泌及胞內(nèi)ROS水平均較對(duì)照組明顯升高。

表1 不同濃度葡萄糖干預(yù)INS-1細(xì)胞后,細(xì)胞分泌胰島素和胞內(nèi)ROS變化(ˉx±s)

表2 不同濃度H2 O2干預(yù)INS-1細(xì)胞后,細(xì)胞分泌胰島素和胞內(nèi)ROS變化(ˉx±s)

2.3 葡萄糖對(duì)INS-1細(xì)胞PTENmRNA表達(dá)的影響 隨著葡萄糖干預(yù)濃度升高,PTENmRNA表達(dá)受到抑制,呈下降趨勢(shì),但當(dāng)葡萄糖濃度超過 11 mmol?L-1時(shí),抑制作用消失,PTENmRNA表達(dá)上升。經(jīng)單因素方差分析法檢驗(yàn),各組細(xì)胞PTEN-mRNA表達(dá)不全相同(P＜0.001);經(jīng)Dunnett法檢驗(yàn)各干預(yù)組與對(duì)照組,結(jié)果顯示葡萄糖濃度為 7 mmol?L-1和11 mmol?L-1與對(duì)照組相比差異顯著,提示葡萄糖濃度為7 mmol?L-1和11 mmol?L-1時(shí),明顯抑制PTENmRNA表達(dá);Dunnett法檢驗(yàn)各干預(yù)組與11 mmol?L-1干預(yù)組,結(jié)果顯示葡萄糖濃度為20 mmol?L-1組與 11 mmol?L-1組之間存在顯著差異,提示葡萄糖濃度為 20 mmol?L-1時(shí),對(duì)PTENmRNA表達(dá)抑制作用消失(圖1、圖3)。

2.4 H2O2對(duì)INS-1細(xì)胞PTENmRNA表達(dá)的影響 隨著H 2 O2干預(yù)濃度升高,PTENmRNA表達(dá)受到抑制,呈下降趨勢(shì),但當(dāng)H2O2濃度超過 2μmol?L-1時(shí),抑制作用消失,PTENmRNA表達(dá)上升。經(jīng)單因素方差分析法檢驗(yàn),各組PTENmRNA表達(dá)不全相同(P=0.006);經(jīng)Dunnett法檢驗(yàn)各干預(yù)組與對(duì)照組,結(jié)果顯示 H 2O2濃度為2μmol?L-1與對(duì)照組相比有顯著差異,提示H 2O2濃度為2μmol?L-1時(shí),明顯抑制PTENmRNA表達(dá);Dunnett法檢驗(yàn)各干預(yù)組與2μmol?L-1干預(yù)組,結(jié)果顯示H2O2濃度為 1 μmol?L-1、6 μmol?L-1、8 μmol?L-1組與2 μmol?L-1組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示低濃度H2O2抑制PTENmRNA表達(dá),H2O2濃度為2μmol?L-1時(shí),抑制作用最強(qiáng);隨著H2O2濃度升高抑制作用減弱,當(dāng)H2 O2濃度達(dá) 6 μmol?L-1、8 μmol?L-1時(shí),對(duì) PTEN-mRNA表達(dá)抑制作用消失(圖2、圖4)。

3 討 論

2008年,糖尿病病理生理研究專家DeFronzo教授指出,β細(xì)胞衰退的進(jìn)程比我們想象的要早得多。胰島素和葡萄糖的比值在正常糖代謝的肥胖人群幾乎已經(jīng)下降了一半,胰島β細(xì)胞功能損失在空腹血糖受損人群中可達(dá)50%,在糖耐量受損人群中可達(dá) 80%,而在新診斷的 2型糖尿病患者中達(dá)90%,β細(xì)胞存活量損失50%。

同其他細(xì)胞類型相比,胰島β細(xì)胞的抗氧化酶表達(dá)低下,清除ROS減少,使得胰島細(xì)胞更易遭受ROS損傷,同時(shí)也為 ROS參與胰島β細(xì)胞代謝信號(hào)通路提供了便利[5]。ROS作為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,其作用的下游信號(hào)途徑包括以下幾種:電壓門控的 K+通道[6]和 Ca+通道[7-8];PTEN及其它的PTPs[4]、c-JUN NH2末端激酶[9]、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控激酶[10]和NFκB[11]等。其中,PTEN是蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)家族的一員,它通過負(fù)向調(diào)控磷酯酰肌醇 3-激酶(PI3K)-蛋白激酶 B(AKT)信號(hào)通路[9],成為重要的腫瘤抑制因子。并成為很多細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的重要調(diào)控點(diǎn)。已有越來越多的研究者[10]開始對(duì)PTEN蛋白表達(dá)、穩(wěn)定性及PTEN基因進(jìn)行研究。迄今為止,尚無ROS是否對(duì)胰島β細(xì)胞PTEN表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用的報(bào)道,而葡萄糖是否通過誘導(dǎo)低濃度ROS生成,抑制胰島β細(xì)胞PTEN表達(dá)而調(diào)控胰島素分泌有待驗(yàn)證。本研究分別用不同濃度葡萄糖和H 2 O2干預(yù)INS-1細(xì)胞30 min,發(fā)現(xiàn)中低濃度葡萄糖和H2O2都可以促進(jìn)細(xì)胞分泌胰島素,同時(shí),細(xì)胞PTENmRNA表達(dá)受到抑制,但隨著刺激濃度進(jìn)一步升高,這種抑制PTENmRNA表達(dá)作用消失,而胰島素分泌繼續(xù)增加。有很多其他研究也支持了本實(shí)驗(yàn)結(jié)果:Pi等[5]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí),在INS-1細(xì)胞和正常小鼠胰島細(xì)胞,高糖刺激細(xì)胞分泌胰島素時(shí),細(xì)胞內(nèi)ROS濃度升高,用低濃度H 2 O2刺激細(xì)胞也可使細(xì)胞分泌胰島素增加。而用抗氧化劑則可抑制細(xì)胞分泌胰島素。有研究[1-2]發(fā)現(xiàn),H 2O2和可刺激細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生H 2 O2的四氧嘧啶,都能刺激大鼠胰腺和INS-1細(xì)胞分泌胰島素,并伴有細(xì)胞內(nèi)Ca+升高。在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞內(nèi),胰島素刺激的細(xì)胞內(nèi)ROS升高,可以氧化抑制PTEN的活性,并引起細(xì)胞內(nèi)PIP3升高[3]。在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞,H2 O2可以氧化抑制PTEN的活性,同時(shí)伴有細(xì)胞內(nèi)PI3K活性增強(qiáng)和PIP3濃度升高;而在敲除PTEN基因的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞內(nèi),H2O2刺激則對(duì)PI3K活性和PIP3濃度無影響。在吞噬細(xì)胞的研究[10-11]也提示H 2O2可以氧化抑制PTEN的活性。但至今,除H2O2氧化抑制PTEN的活性外,對(duì)PTEN表達(dá)影響的報(bào)道少見。

本研究發(fā)現(xiàn)在高濃度葡萄糖和 H 2 O2水平,PTENmRNA表達(dá)不再受到抑制,而有上升趨勢(shì)。隨著干預(yù)INS-1細(xì)胞的葡萄糖和H2 O2濃度升高,PTENmRNA表達(dá)被抑制,但當(dāng)葡萄糖和H2O2濃度升高超過一定程度時(shí),這種抑制作用消失。ROS氧化抑制PTEN途徑只是GSIS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一,而經(jīng)典的ATP依賴胰島素分泌途徑仍然占主要地位;同時(shí),在GSIS過程中,除 ROS外可能還存在很多其它因素影響PTENmRNA的表達(dá)。

很多轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)PTEN基因表達(dá)起調(diào)節(jié)作用。早期生長(zhǎng)反應(yīng)-1(EGR-1)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)和p53都可以直接與PTEN基因的啟動(dòng)子部位結(jié)合,并誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活化[12]。而核因子-κB(NF-κB)則可以抑制PTEN 表達(dá)。用藥物活化 PPARγ可以誘導(dǎo)PTEN基因表達(dá)[13],而細(xì)胞因子誘導(dǎo)的 NF-κB活化則可以使PTEN基因表達(dá)下調(diào)。這些均提示有一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的系統(tǒng)在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)PTEN基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)。

綜上所述,在INS-1細(xì)胞內(nèi),中低濃度葡萄糖代謝會(huì)產(chǎn)生低濃度 ROS,ROS會(huì)抑制PTEN基因的轉(zhuǎn)錄,逆轉(zhuǎn)其對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的負(fù)向調(diào)控,從而介導(dǎo)胰島素分泌。這種抑制PTEN表達(dá)作用在一定濃度范圍內(nèi),隨濃度升高抑制作用增強(qiáng);但超過一定濃度范圍后(如葡萄糖＞11 mmol?L-1,H 2O2＞2 μmol?L-1),則抑制PTEN 表達(dá),介導(dǎo)胰島素分泌的作用消失。這與臨床觀察一致,即血糖升高刺激胰島素分泌增加,但血糖過高反過來對(duì)β細(xì)胞有毒性損害,而空腹血糖超過11.1 mmol?L-1時(shí)高糖毒性明顯。這種ROS對(duì)PTEN表達(dá)調(diào)控的雙重性,體現(xiàn)了機(jī)體ROS作用的復(fù)雜性,對(duì)我們抗氧化劑臨床應(yīng)用研究有重要啟示作用。同時(shí)也可能是PTEN轉(zhuǎn)錄受一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)調(diào)控的結(jié)果反映。此外,ROS對(duì)PTEN在蛋白表達(dá)和功能水平上的氧化抑制作用對(duì)其下游信號(hào)調(diào)節(jié)也至關(guān)重要,葡萄糖刺激引起的ROS升高是否在蛋白表達(dá)和功能水平對(duì)胰島β細(xì)胞PTEN有抑制作用,還有待于進(jìn)一步研究。

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