瘦素在人非小細胞肺癌中的表達及其與腫瘤血管生成的關(guān)系

郭水根 儲德節(jié) 鮑文華 劉 顏 胡志雄 孫書明

(1.復(fù)旦大學附屬金山醫(yī)院呼吸內(nèi)科,上海 200540;2.佳木斯大學第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科,黑龍江佳木斯 154002;3.黑龍江省佳木斯市腫瘤(結(jié)核)醫(yī)院病理科,黑龍江佳木斯 154002)

在與腫瘤相關(guān)的死因中,肺癌居于首位,其中75%～80%是非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。瘦素(leptin)是一種蛋白質(zhì)激素。Bouloumie等[1]發(fā)現(xiàn)瘦素可以作為一種促血管生成因子,刺激形成新生血管,瘦素具有和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)一樣的促進血管內(nèi)皮細胞增殖的效應(yīng)。本研究采用免疫組織化學的方法檢測NSCLC組織及其癌旁正常肺組織中瘦素和VEGF的表達,對兩者與腫瘤血管生成及與NSCLC生物學行為的關(guān)系進行初步研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2002年7月—2005年9月在黑龍江省佳木斯市腫瘤(結(jié)核)醫(yī)院接受手術(shù)治療的60例NSCLC患者的石蠟標本,各例患者術(shù)前均未行放化療,并且排除糖尿病及其他代謝性疾病,術(shù)后標本均經(jīng)病理檢查確診。其中男性42例;女性18例;年齡31～72歲,中位年齡 57.0歲;鱗癌 22例,腺癌38例;高分化 15例,中分化24例,低分化21例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移48例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12例;依據(jù)美國聯(lián)合癌癥分類委員會(AJCC)和國際抗癌聯(lián)盟(UICC)2002年制訂的 TNM分期標準分期:I期12例,II期30例,III期18例。同時取10例同期肺癌手術(shù)患者距癌旁5 cm以上的肺組織作石蠟標本,病理檢查證實為正常肺組織。所有石蠟標本作4μm厚度連續(xù)切片10張,其中1張行HE染色,復(fù)核病理診斷;另9張行免疫組織化學研究。

1.2 試劑與方法 采用鏈霉素抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶法(SP法),對病理組織進行免疫組織化學染色。組織切片常規(guī)脫蠟至水,0.3%H 2O2液封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性10 min,阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性,微波抗原修復(fù)和封閉,SP法染色,DAB顯色。瘦素兔抗人多克隆抗體和VEGF兔抗人多克隆抗體工作液濃度均為1:100。用已知陽性片作陽性對照 ,用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對照。

1.3 結(jié)果判定 Leptin陽性細胞為細胞質(zhì)染成棕黃色顆粒,VEGF陽性判斷標準:胞漿內(nèi)可見染成棕黃色顆粒的細胞。陽性強度判斷:參照 Gatalica等[2]的半定量方法將染色強度與陽性細胞百分數(shù)分為4級:陰性(0級),為無顯色;弱陽性(1級),為＜20%癌細胞陽性或染色呈淺黃色;中等陽性(2級),為20%～50%癌細胞陽性或染色呈黃色;強陽性(3級),為＞50%癌細胞陽性或染色呈棕黃色。每張切片隨機選10個不重復(fù)的高倍視野,每個視野中計100個目標細胞中陽性表達的細胞數(shù),取其均值作為陽性表達率。

1.4 統(tǒng)計學處理 用SPSS10.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)分析。兩組率的比較采用 χ2檢驗;應(yīng)用Spearman等級相關(guān)回歸法分析leptin與VEGF指標間的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 Leptin在NSCLC、正常肺組織中的表達 60例NSCLC標本中,leptin陽性者有41例(68.30%),其中強陽性15例(36.59%),中等陽性19例(46.34%),弱陽性7例(17.07%);而在正常肺組織細胞中僅有3例(30.00%)leptin呈弱陽性表達。NSCLC組織中瘦素表達的陽性率高于正常肺組織,兩者有顯著差異(χ2=3.879,P=0.049),見圖 1、圖 2。

2.2 VEGF在NSCLC和正常肺組織中的表達

VEGF主要在肺癌組織中表達,陽性染色主要局限于細胞漿(圖3、圖4),在切緣區(qū)正常肺組織中表達較弱且多為弱陽性。在60例NSCLC組織中有45例VEGF表達陽性(75%),其中強陽性19例(42.22%),中等陽性 18例(40%),弱陽性8例(17.78%);而在正常肺組織10例中有3例陽性表達(30.00%)且無強陽性表達,NSCLC組織中VEGF表達的陽性率高于正常肺組織,兩者有顯著差異(χ2=6.101,P=0.014),見圖 3、圖4 。

2.3 Leptin、VEGF在NSCLC組織中的表達與臨床病理因素的關(guān)系(表1) 從表1中可見,Leptin、VEGF在NSCLC組織中的表達與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分化程度都存在相關(guān)性,而與腫瘤的病理類型無明顯相關(guān)。

2.4 NSCLC組織中l(wèi)eptin與VEGF陽性表達之間的關(guān)系 用Spearman等級相關(guān)統(tǒng)計分析法示leptin與 VEGF表達呈正相關(guān)(r=0.970,P＜0.01)。

表 1 Leptin、VEGF表達與肺癌臨床病理因素的關(guān)系(例)

3 討 論

在1994年,由Zhang等[3]首次從小鼠和人的脂肪組織中分離并克隆出肥胖基因(ob基因),其編碼的多肽產(chǎn)物即leptin,它是一個由167個氨基酸組成的一種有多靶器官、功能廣泛的分泌型蛋白質(zhì)激素,是機體調(diào)節(jié)身體質(zhì)量的重要物質(zhì)。Leptin的主要生理功能有:抑制攝食、增加能量消耗,減輕體質(zhì)量;調(diào)節(jié)生長發(fā)育,維持正常的生殖功能;調(diào)節(jié)免疫及炎癥;調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌,抑制糖皮質(zhì)激素的分泌,促進生長激素的分泌;保護胃黏膜的完整性;維持正常的血脂代謝等[4]。有研究[5]發(fā)現(xiàn),瘦素與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān),是一種非特異性的腫瘤生長因子,具有抑制腫瘤細胞凋亡,促進其增殖分化,并增加其對基底膜的侵襲能力,還有促血管形成的作用。

本研究結(jié)果提示NSCLC組織瘦素的表達率顯著高于遠離癌塊的正常肺組織,故我們推斷在肺癌組織中瘦素呈異質(zhì)性高表達,在正常人肺組織中有微量瘦素表達。

近年研究已發(fā)現(xiàn)瘦素與腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移有一定的關(guān)系。Ishikawa等[6]研究發(fā)現(xiàn),在61例瘦素高表達的乳腺癌患者中21例有遠處轉(zhuǎn)移(34%);而在15例瘦素受體陰性或瘦素低表達的乳腺癌患者中無遠處轉(zhuǎn)移,前者的生存率低于后者,從而推測瘦素可能以一種自分泌的方式促進乳腺癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床 TNM分期較晚及腫瘤分化度低的NSCLC患者中瘦素表達高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分期較早及高分化的肺癌患者,而瘦素在NSCLC組織中的表達與腫瘤大小及其病理類型均無相關(guān),提示瘦素可能參與了肺癌的浸潤轉(zhuǎn)移過程。我們推測其機制可能為NSCLC以內(nèi)分泌的形式使瘦素分泌增加,繼而上調(diào)MMPs的表達有關(guān),而瘦素在體內(nèi)外均可促進內(nèi)皮細胞的增殖及誘導其表達MMPs;也有可能瘦素通過促進腫瘤血管形成而影響NSCLC的浸潤轉(zhuǎn)移。

VEGF可介導正常的或病理的血管新生,是最重要的促腫瘤血管生成因子之一,在NSCLC中有促腫瘤血管分裂、增殖、遷移及新生血管形成等作用。本研究中75%的NSCLC組織的VEGF染色陽性,且多為陽性或強陽性表達,而周邊正常肺組織VEGF染色僅少數(shù)為弱陽性,提示NSCLC能分泌VEGF,且與正常肺組織相比分泌異常增加。本研究顯示有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織表達的VEGF陽性率更高,VEGF在NSCLC中的表達與腫瘤分化程度有關(guān),提示VEGF在NSCLC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤的分化過程中起著重要的作用。

本研究顯示肺癌組織中瘦素的表達與VEGF的表達呈正相關(guān),而瘦素、VEGF均是強烈的促血管生成因子,由于本研究未同時測定微血管密度(MVD),不能直觀說明瘦素、VEGF表達與血管生成之間的關(guān)系,但是結(jié)合以前的報道和本研究結(jié)果我們可以推測:一方面,NSCLC中高表達的瘦素有可能上調(diào)了VEGF的表達,并通過高表達的VEGF促進了NSCLC中腫瘤血管的生成;另一方面,高表達的瘦素有可能協(xié)同VEGF在NSCLC的血管生成中發(fā)揮作用。

1 Bouloumie A,Drexler HC,Lafontanm,et al.Leptin,the product of Ob gene,promotes angiogenesis[J].Circ Res,1998,83(10):1059-1066.

2 Gatalica Z,Lele SM,Rampy BA,et al.The expression of fhit protein is related inversely to disease progression in patients with breast carcinoma[J].Cancer,2000,88(6):1378-1383.

3 Zhang Y,Proceca R,Maffei M,et al.Positional cloning of the mouse obese gene and it′shuman homogeny[J].Nature,1994,372(1):425-432.

4 施勁東,鄧星奇,李善群,等.血清瘦素腫瘤壞死因子和甲狀腺激素在慢性阻塞性肺疾病患者營養(yǎng)不良發(fā)生中的意義[J].中國臨床醫(yī)學,2008,15(4):489-492.

5 Cao R,Brakenhiclm E,Wahlested t C,et al.Lep tin induces vascular permeability and synergistically stimulates angiogenesis with PGF-2 and VEGF[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(11):6390-6395.

6 Ishik awa M,Kitayama J,Nagawa H.Enhanced expression of leptin and leptin receptor(OB-R)in human breast cancer[J].Clin Cancer Res,2004,10(13):4325-4331.