間充質(zhì)干細胞治療肝臟疾病的研究進展*

林 滬 陳黎明 施 明 王福生

間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal Stem Cell，MSCs）為來源于中胚層間充質(zhì)的成體干細胞，主要存在于骨髓、臍帶血、臍帶、胎盤、外周血及肝臟等器官間質(zhì)和結(jié)締組織中。它們具有獨特的免疫調(diào)節(jié)作用、自我更新和跨胚層多向分化潛能等特點。它們能夠分化為肝細胞樣細胞、纖維母細胞、成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌原細胞以及神經(jīng)外胚泡等。特別是有實驗證明MSCs分化成的肝細胞樣的細胞，具有正常肝細胞功能，如分泌尿素和白蛋白等。所以，MSCs移植治療肝病已成為國內(nèi)外干細胞研究的熱點。

一、MSCs治療肝病進展

大量體內(nèi)外研究表明，MSCs可以促進損傷肝臟修復(fù)、改善癥狀、提高存活率[1，2]，MSCs可以用于治療急性肝衰竭、終末期肝病和遺傳代謝性肝病。

（一）急性肝衰竭 肝衰竭的特點是短時間內(nèi)大量肝細胞的壞死和肝功能的急劇惡化，既往認為，MSCs移植可以提供大量的干細胞分化為肝細胞樣細胞，從而替代正常肝臟所需要的合成和代謝功能。但近期研究發(fā)現(xiàn)，在組織修復(fù)方面，MSCs旁分泌機制改變組織微環(huán)境比MSCs向肝細胞的轉(zhuǎn)化更重要，干細胞移植治療肝損傷受體，只是促進其肝細胞的輕微增殖替代[1]。應(yīng)用MSCs移植治療肝衰竭大鼠模型的多個實驗顯示[2～4]，MSCs可以分泌多種細胞因子，能夠抑制肝細胞凋亡、促進肝細胞增殖及肝臟血管生成，抑制免疫細胞增殖及向肝臟遷移，能夠調(diào)節(jié)肝衰竭大鼠肝臟及全身免疫炎癥反應(yīng)，提高大鼠生存率。實驗顯示[5]，MSCs移植到實驗小鼠后第四周，其增殖數(shù)量僅占受體肝細胞的1%～3%，提示在短時間內(nèi)治療急性肝衰竭，MSCs分化為肝細胞不可能是主要作用。

（二）終末期肝病 在肝硬化的患者肝組織中，假小葉的形成改變了肝內(nèi)的管道結(jié)構(gòu)，阻礙了肝細胞和血漿的交換，使細胞治療很困難。因此，理想的MSCs移植治療是重建肝內(nèi)管道系統(tǒng)，這需要移植MSCs的多向分化與增殖能力。多數(shù)動物實驗證實，MSCs移植能減輕肝纖維化、改善肝功能以及不同程度轉(zhuǎn)化為肝細胞[6]。MSCs治療終末期肝病的多數(shù)臨床實驗顯示，對患者短期治療生活質(zhì)量和肝功有一定程度改善，然而，其效果與動物實驗尚有一定差距。在伊朗，4例失代償肝硬化患者移植自身骨髓MSCs，無副作用發(fā)生，隨訪末生活質(zhì)量評分均提高，有2例患者的終末期肝病評分模型（MELD）評分及肝功得到改善[7]。經(jīng)外周靜脈或門脈將自身骨髓MSCs，移植給8例MELD評分≥10的肝硬化患者（4例乙型肝炎，1例丙型肝炎，1例酒精性，2例病因不明），6月后所有患者均耐受治療，MELD評分顯著下降，白蛋白增加，肝功得到改善[8]。但MSCs移植的臨床實驗尚有缺陷，如病例數(shù)量較少，缺乏對照，缺乏遠期療效和安全性分析等。

（三）遺傳代謝性肝病 細胞移植與基因治療的聯(lián)合應(yīng)用，是目前治療遺傳代謝性肝病的熱門課題，但目前僅限于動物模型研究階段[9]。MSCs的基因修飾是將外源基因轉(zhuǎn)入MSCs，不影響MSCs特性，且可產(chǎn)生相應(yīng)的因子，從而更高效治療各種肝病。已證實多種因子如HGF、IL-3、VIII因子、IFN-β、生長激素、CD-2等可以通過此種方法達到治療的目的。目前已見應(yīng)用干細胞成功治療遺傳代謝性疾病，包括Crigler-Najjar綜合征[10]、原發(fā)性全身性淀粉樣變性[11]等，尚無MSCs應(yīng)用于臨床的文獻，但MSCs因來源廣泛將可能成為最具效力的干細胞。

二、MSCs治療肝病的機制

MSCs除了具有多向分化潛能，更重要的是在損傷肝臟旁分泌一系列營養(yǎng)因子，通過調(diào)節(jié)免疫減輕炎癥反應(yīng)、抗肝細胞凋亡、抗肝纖維化、促進內(nèi)源性肝干細胞分化和刺激內(nèi)源性肝細胞增殖、促進血管增生等修復(fù)肝組織。故MSCs的旁分泌機制是其治療肝病的重要機制[12]。

（一）抗炎 MSCs在異基因移植中能長期存活并發(fā)揮正常的生物學(xué)功能，原因主要有：①獨特的免疫表型：MSCs低表達MHCⅠ類分子，不表達MHCⅡ類分子、FasL和T細胞協(xié)同刺激分子B7等，故免疫原性很弱。實驗證實MSCs在合適的體外分化條件下可以跨胚層分化為內(nèi)胚層的肝實質(zhì)細胞，并且具有移植后不發(fā)生排斥反應(yīng)的特點[13]。②免疫調(diào)節(jié)作用：MSCs能夠分泌可溶性細胞因子介導(dǎo)免疫抑制及誘導(dǎo)免疫耐受。通過阻斷抗原遞呈細胞的成熟和功能、抑制B細胞分化、降低T細胞和NK細胞的免疫應(yīng)答能力，從而非特異性地抑制同種異基因淋巴細胞增殖。將包含大量因子的MSCs條件培養(yǎng)液，其中有胰島素樣生長因子、白細胞介素（IL）-8、肝細胞生長因子、成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、腫瘤壞死因子（TNF）、轉(zhuǎn)化生長因子等，經(jīng)靜脈注入肝衰竭大鼠，肝臟組織學(xué)檢查示，小葉旁白細胞侵潤、肝細胞壞死和膽管復(fù)制均明顯減少；CT檢查表明，MSCs條件培養(yǎng)液改變了白細胞的遷移，使白細胞繼發(fā)性從損傷肝臟轉(zhuǎn)移，說明MSCs條件培養(yǎng)液可抑制免疫細胞增殖及向肝臟遷移，能夠減輕損傷肝臟的炎癥反應(yīng)，提高了大鼠存活率[1]。除了細胞免疫反應(yīng)，體液免疫反應(yīng)也是肝損傷炎癥反應(yīng)的重要組成，控制該反應(yīng)的關(guān)鍵是，減輕前炎性細胞因子如TNF-α和IL-1的細胞毒作用。MSCs分泌IL-1受體拮抗劑（IL-1RA），抑制前炎癥細胞因子的產(chǎn)生，并上調(diào)抗炎細胞因子如IL-10[14]。

（二）抗凋亡 研究顯示，MSCs可通過旁分泌機制分泌相關(guān)細胞因子，如基質(zhì)細胞衍生因子-1、血管內(nèi)皮生長因子等，抑制各種類型受體細胞凋亡，其中SDF-1/CXCR-4軸具有重要調(diào)節(jié)作用。人骨髓MSCs植入肝衰竭大鼠體內(nèi)，大鼠明顯降低的死亡率與凋亡肝細胞數(shù)量減少相關(guān)[1]。在急性肝損傷大鼠模型[15]，靜脈灌注MSC條件培養(yǎng)液后，阻止了肝損傷生物標記的釋放，使肝細胞凋亡減少90%，增殖期肝細胞數(shù)量增加3倍，體外實驗也證實MSC條件培養(yǎng)液的直接抗凋亡和促進肝細胞有絲分裂。

（三）抗纖維化 大量動物及臨床實驗證明[7，16]，MSCs移植能抑制肝細胞內(nèi)TGF-β1、平滑肌肌動蛋白（α-SMA）表達，減輕肝纖維化程度。MSCs移植抗肝纖維化的機制目前多數(shù)認為，MSCs通過旁分泌機制調(diào)節(jié)肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）的功能，分泌抗纖維化物質(zhì)如HGF直接誘導(dǎo)HSC凋亡，分泌IL-10和TNF-α抑制HSC增殖及基質(zhì)合成[17]，移植的MSCs表達高水平的基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metallo proteinase，MMP）-9直接降解 ECM[18]等減少細胞外基質(zhì)沉積、抑制肝組織纖維化的形成。但MSCs移植抗纖維化尚有爭議，有實驗證實[19]，MSCs移植入肝纖維化患者或小鼠體內(nèi)的MSCs傾向于分化為HSC和肌纖維母細胞，發(fā)揮促肝纖維化作用。

（四）分化 研究證明，干細胞所處的微環(huán)境是其定向分化的決定因素。細胞局部的微環(huán)境包括多種細胞因子、激素、基質(zhì)細胞、細胞外基質(zhì)等，細胞因子的作用尤為重要，不同的細胞因子作用下MSCs可分化為不同的細胞類型。肝損傷局部微環(huán)境的改變，可產(chǎn)生多種細胞因子，促進和增強MSCs的分化；另一方面，MSCs在損傷肝臟可反應(yīng)性分泌HGF、FGFs、TGF-β、EGF、IL-10等多種因子促進損傷肝組織修復(fù)。MSCs通過磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidyl inositol-3-kinase，PI3K）、MEK、P38、核因子（nuclear factor，NF-κB）等機制，介導(dǎo)EGF受體和TNF受體間的交互作用，產(chǎn)生HGF、EGF、FGFs等因子[20-22]。其中，由非肝實質(zhì)細胞或間充質(zhì)細胞分泌的HGF是誘導(dǎo)分化為肝細胞的關(guān)鍵因子，它通過與MSCs膜表面特異性受體c-Met結(jié)合，能促進多種細胞的有絲分裂。

此外，F(xiàn)GFs、EGF、TNF-α、IL-3、IGF、干細胞因子（stem cell factor，SCF）、制瘤素 M（oncostatin，OSM）、曲古菌素 A、內(nèi)毒素、糖皮質(zhì)激素、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉（insulintransferrin-sodium selenite，ITS）、尼克酰胺等也參與了MSCs向肝系的分化，與 HGF 起協(xié)同作用[23～25]。其中，HGF、FGFs在肝細胞的發(fā)育和增殖中有不可替代的作用。

（五）血管形成 理想的干細胞移植治療是修復(fù)或重建肝內(nèi)管道系統(tǒng)，即接近于正常肝臟功能需求的動脈、門靜脈和膽道系統(tǒng)。MSCs具有跨胚層多向分化潛能，在合適的分化條件下，可以跨胚層分化為內(nèi)胚層的肝細胞樣細胞、膽管細胞和血管內(nèi)皮樣細胞[26]。但干細胞在肝臟管道形成中的確切作用尚有待進一步研究。肝臟再生增殖與新生血管的形成有關(guān)，而MSCs可為新生血管及其側(cè)枝形成提供營養(yǎng)支持。實驗證實[27，28]，IGF-1、HGF、IL6、IL8、IL11、VEGF、FGF、單核細胞化學(xué)引誘蛋白（monocyte chemoattractant protein，MCP-1）、骨形態(tài)形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）-2均促進新生血管形成和改善器官缺血狀況。研究證實[29]，Notch/Jagged信號通路在MSCs向肝細胞樣細胞、膽管細胞和血管內(nèi)皮樣細胞的分化、成熟過程中起重要作用。

三、MSCs治療肝病的副作用

（一）致癌性 理論上，MSCs可通過直接轉(zhuǎn)化、抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)和對腫瘤細胞的營養(yǎng)作用等導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，具體機制尚不清楚。Wnt信號是生長刺激信號，可促進MSCs的增殖和分化，當(dāng)Wnt信號抑制，MSCs可導(dǎo)致肉瘤發(fā)生[30]。

（二）免疫能力下降 MSCs非特異性地抑制同種異體淋巴細胞增殖。臨床實驗中，9名移值物抗宿主疾病患者經(jīng)MSCs移植后，有3例出現(xiàn)病毒感染[31]，提示MSCs所致免疫抑制可能導(dǎo)致機體對病原體免疫監(jiān)視的減弱。

（三）多向分化 有研究表明骨髓MSCs移植可引起鈣化或向骨骼分化[32]，也可分化為成纖維細胞表型[19]，故多分化潛能的不可調(diào)控性是骨髓MSCs主要缺陷。

四、問題與展望

盡管關(guān)于MSCs的研究已取得較大進展，但臨床廣泛應(yīng)用前尚有許多問題尚待明確。首先，進一步闡明MSCs移植治療機制及MSCs分化機制，以利增強MSCs的定向誘導(dǎo)分化及保障移植的安全性；其次，明確MSCs在受體內(nèi)存活、增殖及分化情況，必要時采用示蹤法觀察；第三，合理設(shè)計多中心隨機雙盲對照臨床研究驗證療效，并了解移植可能發(fā)生的副作用或并發(fā)癥。隨著上述問題的解決，MSCs移植應(yīng)用于臨床治療肝病將極具前景。

[1]PAREKKADAN B，VAN POLL D，SUGANUMA K，et al.Mesenchymal stem cell-derived molecules reverse fulminant hepatic failure[J].PLoS ONE，2007，2（9）:e941.

[2]BANAS A，TERATANI T，YAMAMOTO Y，et al.Rapid hepatic fate specification of adipose-derived stem cells and their therapeutic potential for liver failure[J].J Gastroenterol Hepatol，2009，24（1）:70-77.

[3]ALISON MR，ISLAM S，LIM S.Stem cells in liver regeneration，fibrosis and cancer:the good，the bad and the ugly[J].J Pathol，2009，217（2）:282-298.

[4]YAGI H，PAREKKADAN B，SUGANUMA K，et al.Long term superior performance of a stem cell/hepatocyte de vice for the treatment of acute liver failure[J].Tissue Eng Part A，2009，15（11）:3377-3388.

[5]KUO TK，HUNG SP，CHUANG CH，et a1.Stem cell therapy for liver disease:parameters governing the success of using bone marrow mesenchymal stem cells[J].Gastroenterology，2008，134（7）:2111-2121.

[6]BANAS A，TERATANI T，YAMAMOTO Y，et al.IFATS collection:in vivo therapeutic potential of human adipose tissue mesenchymal stem cells after transplantation into mice with liver injury[J].Stem Cells，2008，26（10）:2705-2712.

[7]MOHAMADNEJAD M，ALIMOGHADDAM K， MOHYEDDIN-BONAB M，et al.Phase I trial of autologous bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in patients with decompensated cirrhosis[J].Arch Iran Med，2007，10（4）:459-466.

[8]KHARAZIHA P，HELLSTR M PM，NOORINAYER B，et al.Improvement of liver function in liver cirrhosis patients after autologous mesenchymal stem cell injection:a phase I-II clinical trial[J].Eur J Gastroenterol Hepatol，2009，21（10）:1199-1205.

[9]MIRANDA PS，BOSMA PJ.Towards liver-directed gene therapy for Crigler-Najjar syndrome[J].Curr Gene Ther，2009，9（2）:72-82.

[10]KHAN AA，PARVEEN N，MAHABOOB VS，et al.Treatment of Crigler-Najjar syndrome type 1 by hepatic progenitor cell transplantation:a simple procedure for management of hyperbilirubinemia[J].Transplant Proc，2008，40（4）:1148-1150.

[11]FROSSARD V，KETTERER N，ROSSELET A，et al.Early intensification and autologous stem cell transplantation in patients with systemic AL amyloidosis:a single-centre experience[J].Ann Hematol，2009，88（7）:681-685.

[12]ZHOU P，HOHM S，OLUSANYA Y，et al.Human progenitor cells with high aldehyde dehydrogenase activity efficiently engraft into damaged liver in a novel model[J].Hepatology，2009，49（6）:1992-2000.

[13]FERREIRA E，POTIER E，LOGEART-AVRAMOGLOU D，et al.Optimization of a gene electrotransfer method for mesenchymal stem cell transfection[J].Gene Ther，2008，15（7）:537-544.

[14]ORTIZ LA，DUTREIL M，F(xiàn)ATTMAN C，et al.Interleukin 1 receptor antagonist mediates the antiinflammatory and antifibrotic effect of mesenchymal stem cells during lung injury[J].Proc Natl Acad Sci USA，2007，104（26）:11002-11007.

[15]VAN POLL D，PAREKKADAN B，CHO CH，et al.Mesenchymal stem cell-derived molecules directly modulate hepatocellular death and regeneration in vitro and in vivo[J].Hepatology，2008，47（5）:1634-1643.

[16]TSAI PC，F(xiàn)U TW，CHEN YM，et al.The therapeutic potential of human umbilical mesenchymal stem cells from Wharton’s jelly in the treatment of rat liver fibrosis[J].Liver Transpl，2009，15（5）:484-495.

[17]PAREKKADAN B，VAN POLL D，MEGEED Z，et al.Immunomodulation of activated hepatic stellate cells by mesenchymal stem cells[J].Biochem.Biophys Res Commun，2007，363（2）:247-252.

[18]HIGASHIYAMA R，INAGAKI Y，HONG YY，et al.Bone marrow-derived cells express matrix metalloproteinases and contribute to regression of liver fibrosis in mice[J].Hepatology，2007，45（1）:213-222.

[19]CARVALHO AB，QUINTANILHA LF，DIAS JV，et al.Bone marrow multipotent mesenchymal stromal cells do not reduce fibrosis or improve function in a rat model of severe chronic liver injury[J].Stem Cells，2008，26（5）:1307-1314.

[20]WANG Y，WEIL BR，HERRMANN JL，et al.MEK，p38 and PI-3K mediate cross talk between EGFR and TNFR in enhancing hepatocyte growth factor production from human mesenchymal stem cells[J].Am J Physiol Cell Physiol，2009，297（5）:C1284-1293.

[21]WANG Y，WANG M，ABARBANELL AM，et al.MEK mediates the novel cross talk between TNFR2 and TGF-EGFR in enhancing vascular endothelial growth factor（VEGF）secretion from human mesenchymal stem cells[J].Surgery，2009，146（2）:198-205.

[22]CRISOSTOMO PR，WANG Y，MARKEL TA，et al.Human mesenchymal stem cells stimulated by TNF-alpha，LPS，or hypoxia produce growth factors by an NF kappa B-but not JNK-dependent mechanism[J].Am J Physiol Cell Physiol，2008，294（3）:C675-682.

[23]AURICH H，SGODDA M，KALTWASSER P，et al.Hepatocyte differentiation of mesenchymal stem cells from human adipose tissue in vitro promotes hepatic integration in vivo[J].Gut，2009，58（4）:570-581.

[24]BONORA-CENTELLES A，JOVER R，MIRABET V，et al.Sequential hepatogenic trans-differentiation of adipose tissue-derived stem cells:relevance of different extracellular signaling molecules，transcription factors involved and expression of new key marker genes[J].Cell Transplant，2009，18（12）:1319-1340.

[25]BANAS A，TERATANI T，YAMAMOTO Y，et al.Rapid hepatic fate specification of adipose-derived stem cells and their therapeutic potential for liver failure[J].J Gastroenterol Hepatol，2009，24（1）:70-77.

[26]DENG X，CHEN YX，ZHANG X，et al.Hepatic stellate cells modulate the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into hepatocyte-like cells[J].J Cell Physiol，2008，217（1）:138-144.

[27]POTAPOVA，IA，GAUDETTE GR，BRINK PR，et al.Mesenchymal stem cells support migration，extracellular matrix invasion，proliferation and survival of endothelial cells in vitro[J].Stem Cells，2007，25（7）:1761-1768.

[28]SADAT S，GEHMERT S，SONG YH，et al.The cardioprotective effect of mesenchymal stem cells is mediated by IGF-I and VEGF[J].Biochem Biophys Res Commun，2007，363（3）:674.

[29]SHAFRITZ DA，OERTEL M，MENTHENA A，et al.Liver stem cells and prospects for liver reconstitution by transplanted cells[J].Hepatology，2006，43（2 Suppl 1）:S89-98.

[30]MATUSHANSKY I，HERNANDO E，SOCCI ND，et al.Derivation of sarcomas from mesenchymal stem cells via inactivation of the Wnt pathway[J].J Clin Invest，2007，117（11）:3248-3257.

[31]SUNDIN M，ORVELL C，RASMUSSON I，et al.Mesenchymal stem cells are susceptible to human herpes viruses，but viral DNA cannot be detected in the healthy seropositive individual[J].Bone Marrow Transplant，2006，37（11）:1051-1059.

[32]BREITBACH M，BOSTANI T，ROELL W，et al.Potential risks of bone marrow cell transplantation into infarcted hearts[J].Blood，2007，110（4）:1362-1369.