端粒和端粒酶在乙型肝炎、肝硬化和肝癌中的研究現(xiàn)狀*

王麗華 綜述 朱傳武 陳 明 審校

端粒是真核細(xì)胞染色體末端的重要結(jié)構(gòu)，端粒酶是維持端粒長(zhǎng)度的RNA依耐性DNA聚合酶。近年來(lái)，在基礎(chǔ)和臨床研究方面對(duì)端粒和端粒酶進(jìn)行了大量的研究，并取得了較大的進(jìn)展，現(xiàn)綜述如下。

一、端粒的結(jié)構(gòu)與功能

端粒是線性染色體末端的核蛋白結(jié)構(gòu)，其功能是防止染色體發(fā)生末端融合和重組。在大多數(shù)器官里，端粒DNA是富含鳥(niǎo)苷酸的簡(jiǎn)單串聯(lián)重復(fù)序列（TTAGGG），四個(gè)TTAGGG重復(fù)序列折疊成一個(gè)G-四倍體。對(duì)于端粒酶而言，這是一個(gè)惰性底物，這種特性不但為抑制端粒酶的活性提供了分子機(jī)制，而且更多地影響了端粒的功能[1]。端粒被六種核心蛋白TRF1、TRF2、RAP1、TIN2、TIPP1 和 POT1 組成的復(fù)合物所保護(hù)，這種復(fù)合物稱為屏障因子，有助于防止端粒被作為DNA雙鏈缺口加以識(shí)別，發(fā)生同源重組和非同源重組并進(jìn)行不恰當(dāng)?shù)男迯?fù)[2]。端粒DNA最末端為一3’端單鏈突出物，稱之為G尾。在哺乳類動(dòng)物細(xì)胞里，這種突出物能侵入端粒最近的區(qū)域形成一個(gè)特別的D環(huán)。重要的蛋白通過(guò)DNA與蛋白、以及蛋白與蛋白的相互作用募集到端粒上。

在缺乏端粒酶延長(zhǎng)機(jī)制時(shí)，由于傳統(tǒng)的DNA聚合酶不能復(fù)制端粒，故隨著細(xì)胞的不斷分裂端粒DNA逐漸丟失。有研究[3，4]表明，單鏈端粒的缺失足以生成至少兩種早期癌細(xì)胞表型。同時(shí)，癌細(xì)胞通過(guò)激活端粒自我平衡程序獲得無(wú)限或非常大的增殖潛力。細(xì)胞培養(yǎng)模型研究顯示，復(fù)制衰老和端粒耗損有密切的關(guān)系，年長(zhǎng)者端粒長(zhǎng)度較年輕者為短，但體內(nèi)端?？s短對(duì)人類老化的影響還難以證明，包括端粒功能障礙對(duì)年齡相關(guān)的病理變化也是如此。

細(xì)胞在進(jìn)化過(guò)程中已經(jīng)形成對(duì)抗端粒DNA逐漸丟失的機(jī)制。在某些器官，端粒以重組的方式維持端粒長(zhǎng)度。在另外一些器官，端粒的長(zhǎng)度由端粒酶合成。在某些癌組織中檢測(cè)不到端粒酶，這些癌細(xì)胞使用一種非傳統(tǒng)的端粒延長(zhǎng)（alternative lengthening of telomeres，ALT）方式來(lái)維持端粒長(zhǎng)度[3]。Gatbonton等[5]發(fā)現(xiàn)在酵母菌中，刪除72個(gè)基因可致短端粒，而有80個(gè)基因是與野生型酵母菌的長(zhǎng)端粒有關(guān)的。他們還發(fā)現(xiàn)有39個(gè)基因?qū)Χ肆Ｃ溉狈?xì)胞的增殖或端粒長(zhǎng)度維持起重要作用，包括參與脫氧核苷酸的生物合成，姐妹染色質(zhì)的黏附，空泡蛋白分類等。

二、端粒酶的結(jié)構(gòu)與功能

在細(xì)胞復(fù)制期間，由于端粒DNA末端不能復(fù)制，因此端粒長(zhǎng)度進(jìn)行性縮短。為了避免端粒過(guò)度縮短導(dǎo)致細(xì)胞復(fù)制終止，真核細(xì)胞在進(jìn)化中形成了一種特殊逆轉(zhuǎn)錄酶——端粒酶，其功能是通過(guò)將DNA重復(fù)序列添加到染色體的3’末端以對(duì)抗端粒的持續(xù)降解。端粒酶是一種高度特異化核蛋白復(fù)合物，為端粒DNA延長(zhǎng)提供RNA模板序列[6]，包括兩個(gè)基本核心成分，端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶或稱為端粒酶催化亞單位（telomerase reverse transcriptase，TERT） 和端粒酶 RNA（telomerase RNA，TR），以及幾個(gè)端粒酶相關(guān)輔助蛋白。具有催化活性的TERT蛋白使用TR成分中的短序列作為模板合成端粒DNA。人類端粒酶RNA成分包括了451個(gè)核苷酸，5’端一半折疊入保守的催化核心，組成了模板區(qū)域和附近的假結(jié)節(jié)區(qū)域[7]。TR的大小因物種的不同而差異顯著，纖毛蟲(chóng)150個(gè)核苷酸（nt），脊椎動(dòng)物556nt，酵母菌超過(guò) 1500nt。人們應(yīng)用種系對(duì)比分析法為每個(gè)物種建立了TR二級(jí)結(jié)構(gòu)模式。從纖毛蟲(chóng)、酵母到脊椎類生物，TR結(jié)構(gòu)共享一個(gè)模板區(qū)域附近相似的假結(jié)節(jié)結(jié)構(gòu)。Feng等[8]研究發(fā)現(xiàn)，S.cerevisiae TLC1RNA核心區(qū)域包含了一個(gè)保守的三級(jí)螺旋結(jié)構(gòu)，這種三級(jí)螺旋結(jié)構(gòu)的降解造成了體外端粒酶活性的下降和體內(nèi)端粒的縮短，并且與蛋白亞單位的結(jié)合力沒(méi)有改變。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，三級(jí)螺旋結(jié)構(gòu)接近端粒引物的3’末端與模板綁定。端粒酶RNAs三級(jí)螺旋區(qū)域的一個(gè)或多個(gè)2'-OH對(duì)催化起重要作用。Shefer等[9]在體外用用寡聚核苷酸證實(shí)了三級(jí)螺旋結(jié)構(gòu)的形成，而且證實(shí)其對(duì)端粒酶的功能是必需的。但是，三倍體干擾突變廢除了端粒酶的功能，G-CC三倍體的補(bǔ)償突變以pH依賴的方式恢復(fù)假結(jié)節(jié)結(jié)構(gòu)，并且部分恢復(fù)體內(nèi)端粒酶功能。另外，一種新類型的G-CU三級(jí)螺旋結(jié)構(gòu)，也能部分恢復(fù)假結(jié)節(jié)的結(jié)構(gòu)和功能。Yu等[10]研究發(fā)現(xiàn)，纖毛端粒酶RNA基本功能結(jié)構(gòu)域是四級(jí)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，可強(qiáng)烈地刺激端粒酶活性和轉(zhuǎn)錄加工過(guò)程。通過(guò)大量結(jié)構(gòu)和功能的研究，發(fā)現(xiàn)這些結(jié)構(gòu)特征和酶的活性殘基對(duì)TERT蛋白結(jié)合沒(méi)有明顯的影響。有研究[11]表明，Kluyveromyces lactis TER的5’臂對(duì)端粒酶功能起關(guān)鍵作用，它可能與Est3的功能有關(guān)。

David等[12]研究證實(shí)，基本的端粒DNA結(jié)合蛋白Cdc13p對(duì)芽殖酵母的端粒長(zhǎng)度具有雙向調(diào)節(jié)作用，他們發(fā)現(xiàn)Cdc13p通過(guò)三種完全不同的方式抑制端粒酶的活性，包括一種新的遠(yuǎn)距離的抑制方式。Zhang等[13，14]發(fā)現(xiàn)以前參與端粒長(zhǎng)度調(diào)節(jié)的異源性核蛋白A1（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1，hnRNPA1）結(jié)合到DNA單鏈和具有人端粒重復(fù)序列的結(jié)構(gòu)，擾亂了單鏈和端粒的高級(jí)結(jié)構(gòu)。應(yīng)用體外端粒酶實(shí)驗(yàn)，觀察到hnRNPA A/B蛋白顯著下調(diào)了端粒酶活性，加入純化的重組hnRNPA可增加端粒酶活性。研究表明hnRNPA1的功能是作為端粒酶全酶的輔助因子而非必需因子。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，hnRNPA1與體內(nèi)端粒有聯(lián)系，認(rèn)為hnRNPA1通過(guò)每次轉(zhuǎn)位步驟中形成的G四級(jí)結(jié)構(gòu)或G-G發(fā)夾結(jié)構(gòu)的松解刺激端粒延長(zhǎng)，G-四倍體是富含鳥(niǎo)苷酸的DNA序列。盡管在大多數(shù)成人體細(xì)胞中端粒酶處于失活狀態(tài)，但是在90%的人類癌癥細(xì)胞中會(huì)被再激活，并且端粒酶對(duì)端粒長(zhǎng)度的維持是導(dǎo)致這些細(xì)胞持續(xù)增殖的重要機(jī)制。

三、端粒、端粒酶與免疫應(yīng)答

典型的免疫應(yīng)答依賴于兩種功能淋巴細(xì)胞，即T細(xì)胞和B細(xì)胞。免疫應(yīng)答起始于T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞對(duì)抗原的識(shí)別和結(jié)合，并導(dǎo)致特異性淋巴細(xì)胞的大量擴(kuò)增。淋巴細(xì)胞的端?？s短到一定長(zhǎng)度，無(wú)論發(fā)生在單倍體還是多倍體染色體末端，細(xì)胞均停止分裂并且衰老死亡或發(fā)生凋亡。端粒具有計(jì)數(shù)細(xì)胞分裂次數(shù)的功能并限制了正常體細(xì)胞分裂的次數(shù)。最近研究表明[15]，衰老的細(xì)胞與新生的細(xì)胞相比，端粒明顯縮短，一方面是由于細(xì)胞分裂后，累積的端?？s短，另一方面是由于端粒酶活性的缺乏或不足，表明端粒在決定這些細(xì)胞的復(fù)制壽命上起重要作用。從初始T細(xì)胞分化為記憶細(xì)胞經(jīng)歷多次細(xì)胞分裂導(dǎo)致端粒重復(fù)序列的縮短，然而這種累積的端粒縮短是否最終影響記憶T細(xì)胞的功能現(xiàn)在還不明確。在T細(xì)胞分化和分裂過(guò)程中，端粒損耗的速率也不清楚。T細(xì)胞端粒酶表達(dá)研究表明，在T細(xì)胞發(fā)育和分化過(guò)程中端粒酶活性明顯上調(diào)。隨著每個(gè)周期刺激后體外T細(xì)胞增殖能力下降，激活T細(xì)胞端粒酶的活性也下降。在初始B細(xì)胞分化為記憶B細(xì)胞的過(guò)程中，端粒長(zhǎng)度沒(méi)有明顯丟失。與T細(xì)胞一致的是，在靜止的B細(xì)胞端粒酶并不表達(dá)，但在絲裂原刺激后酶的活性則迅速激活。結(jié)果表明在B細(xì)胞分化過(guò)程中，端粒酶的活性不僅能夠被調(diào)節(jié)，而且能夠延長(zhǎng)體內(nèi)端粒長(zhǎng)度。

四、乙型肝炎患者外周血淋巴細(xì)胞人TERT（hTERT）的表達(dá)

在淋巴細(xì)胞發(fā)育、分化和激活過(guò)程中，端粒酶活性及TERT的表達(dá)明顯上調(diào)，表明端粒酶在控制淋巴細(xì)胞復(fù)制壽命中的潛在作用。淋巴細(xì)胞端粒縮短被認(rèn)為是免疫衰老的標(biāo)志，如果端粒酶阻止淋巴細(xì)胞端?？s短，則對(duì)免疫功能，器官老化和癌癥的發(fā)生均起重要作用。HBV感染的外周血淋巴細(xì)胞，包括免疫細(xì)胞的選擇和T淋巴細(xì)胞凋亡的增加導(dǎo)致了免疫應(yīng)答受損。在慢性HBV感染患者的研究中，宿主免疫功能障礙可能與hTERT有關(guān)。因此，患者外周血淋巴細(xì)胞中hTERT的表達(dá)受到了高度重視。

無(wú)論端粒酶活性如何，人類TR在所有組織均會(huì)高表達(dá)，但只有hTERT mRNA的表達(dá)與端粒酶的活性密切相關(guān)。上調(diào)淋巴細(xì)胞端粒酶的活性，可能會(huì)有效阻止分裂中的淋巴細(xì)胞發(fā)生端?？s短，保證淋巴細(xì)胞持續(xù)增殖。如果端粒酶活性很低，淋巴細(xì)胞則不斷發(fā)生端?？s短。因此，淋巴細(xì)胞端粒酶活性下降會(huì)影響宿主的免疫功能，這已在HIV感染的患者中得到了證實(shí)[16]，說(shuō)明人類淋巴細(xì)胞端粒長(zhǎng)度、端粒酶活性與宿主的免疫功能有關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn)[17]，HBV感染患者外周血淋巴細(xì)胞中hTERT mRNA表達(dá)比正常對(duì)照人群顯著下降，而hTERT mRNA的水平與端粒酶的催化活性密切相關(guān)，因此提示端粒酶可能間接參與了慢性乙型肝炎的免疫病理?yè)p傷。在慢性乙型肝炎患者中，hTERT mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)的下降與患者的臨床狀態(tài)、年齡、性別或者丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平無(wú)關(guān)，但其病程與hTERT mRNA的水平呈負(fù)相關(guān)。研究結(jié)果表明，慢性乙型肝炎患者淋巴細(xì)胞中較低水平的hTERT mRNA表達(dá)與慢性肝炎的免疫病理有關(guān)，這也反映了免疫系統(tǒng)的過(guò)早衰老，因此可能與慢性乙肝中肝癌的高發(fā)病率有關(guān)。

五、肝硬化和肝癌中端粒酶及hTERT的變化

Yao等[18]研究了端粒酶在肝癌發(fā)生中的動(dòng)態(tài)變化，以及端粒酶在肝組織和外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)對(duì)肝癌的診斷意義。發(fā)現(xiàn)在肝癌的發(fā)展過(guò)程中端粒酶是呈動(dòng)態(tài)變化的，在肝細(xì)胞的退化、癌前病變和癌化的各個(gè)階段，端粒酶的活性和肝臟總RNA水平一致。在肝癌患者肝組織中端粒酶水平較癌旁組織明顯增高。以較低的吸光度評(píng)價(jià)，正常對(duì)照、慢性乙型肝炎、肝硬化和肝癌組中外周血端粒酶的陽(yáng)性率分別是15.7%、25%、45.9%和85.2%。如以較高的吸光度評(píng)價(jià)，則肝癌組為60%，而其他組均為0。將外周血端粒酶和血清AFP水平相結(jié)合可顯著增加肝癌診斷的陽(yáng)性率和準(zhǔn)確度。因此，端粒酶的過(guò)度表達(dá)與肝癌的發(fā)生有關(guān)，可作為肝癌的診斷標(biāo)志。

有學(xué)者[19]用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)了hTERT mRNA轉(zhuǎn)錄水平、實(shí)時(shí)PCR與Southern blot檢測(cè)了hTERT、c-myc mRNA的基因表達(dá)水平。共檢測(cè)了44例肝臟結(jié)節(jié)，包括5個(gè)再生結(jié)節(jié)，14個(gè)低等級(jí)發(fā)育不良結(jié)節(jié)，7個(gè)高等級(jí)發(fā)育不良結(jié)節(jié)，11個(gè)肝癌病灶的不良增生結(jié)節(jié)，17個(gè)肝癌病灶和23個(gè)慢性肝炎或肝硬化肝臟組織，6個(gè)正常肝組織。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，hTERT mRNA水平隨肝癌發(fā)生的進(jìn)展而增加，大多數(shù)高等級(jí)結(jié)節(jié)所表達(dá)的hTERT mRNA與肝癌組織類似。有21%的低等級(jí)結(jié)節(jié)具有較高水平的hTERT mRNA，接近于高等級(jí)結(jié)節(jié)的水平，但在低等級(jí)結(jié)節(jié)中hTERT mRNA水平的高低與病理特征無(wú)關(guān)。提示檢測(cè)hTERT mRNA可以發(fā)現(xiàn)肝臟結(jié)節(jié)的癌化趨勢(shì)，肝癌發(fā)生時(shí)hTERT和c-myc mRNA的基因表達(dá)不是調(diào)節(jié)hTERT mRNA轉(zhuǎn)錄的主要機(jī)制。

六、HBV蛋白與hTERT mRNA變化的關(guān)系

Guo等[20]用免疫組化檢測(cè)30例HBsAg陽(yáng)性和17例HB－sAg陰性原發(fā)性肝癌中hTERT蛋白表達(dá)，用RT-PCR法分析hTERT mRNA表達(dá)的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：hTERT蛋白主要分布于肝癌細(xì)胞胞質(zhì)，偶爾分布于胞核。HBsAg陽(yáng)性患者h(yuǎn)TERT蛋白及其mRNA的陽(yáng)性率分別是93.33%和83.33%，而HBsAg陰性患者h(yuǎn)TERT蛋白及其mRNA的陽(yáng)性率分別是 52.94%和 47.06%。表明在人肝癌細(xì)胞中，HBsAg與hTERT mRNA的表達(dá)是相關(guān)的，HBV的蛋白成分可能通過(guò)激活hTERT基因在肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化和癌癥發(fā)生過(guò)程中起重要作用。另一項(xiàng)研究通過(guò)將HBV X基因轉(zhuǎn)染到人類肝癌細(xì)胞系和膽管癌細(xì)胞后，其hTERT mRNA表達(dá)上調(diào)，表明HBx基因能上調(diào)hTERT mRNA轉(zhuǎn)錄，HBx基因所致的hTERT基因激活可能是HBV感染患者肝癌和膽管癌發(fā)生的分子機(jī)制之一[21]。

Zhang等[22]檢測(cè)了34例肝癌和相應(yīng)癌旁組織，30例肝硬化和6例正常肝組織，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織、癌旁組織和硬化肝組織中hTERT的陽(yáng)性率分別為67.6%、73.5%和100%，但在正常肝組織中未發(fā)現(xiàn)hTERT呈陽(yáng)性。在腫瘤組織中HBsAg、HBcAg和HBxAg的陽(yáng)性率分別為58.8%、26.5%和76.5%；在癌旁組織中的陽(yáng)性率分別為64.7%、41.2%和85.3%；在硬化肝組織中分別為76.7%、66.7%和100%。結(jié)果顯示，hTERT表達(dá)和這些組織中HBxAg的表達(dá)無(wú)顯著差異。Western-blot分析顯示，在HBx基因短時(shí)轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞中，c-myc和hTERT的表達(dá)比對(duì)照組要高得多；用靶區(qū)擴(kuò)增多態(tài)性（TRAP）方法檢測(cè)端粒酶的活性，也得出了類似的結(jié)果。研究表明HBx上調(diào)了肝腫瘤細(xì)胞hTERT的表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)展有關(guān)。

七、hTERT mRNA檢測(cè)的臨床意義

血清中hTERT mRNA可以作為一種新的腫瘤標(biāo)志。Miura等[23]檢測(cè)了64例肝癌、20例肝硬化、20例慢性肝炎和50例健康個(gè)體血清hTERT mRNA水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝癌比慢性肝病患者具有更高的血清hTERT mRNA水平，hTERT mRNA的表達(dá)與腫瘤面積、數(shù)量和分化程度等變量呈現(xiàn)獨(dú)立相關(guān)關(guān)系。在診斷肝癌方面，hTERT mRNA的敏感性和特異性分別是88.2%和70.0%，而AFP mRNA分別是71.6%和67.5%。由于血清與肝癌組織中的hTERT mRNA是相關(guān)的，因此血清hTERT mRNA比AFP mRNA對(duì)肝癌的診斷更具優(yōu)越性，可以作為一種新的、有價(jià)值的腫瘤診斷標(biāo)志物。

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