中藥補髓健腦方對帕金森小鼠模型行為學(xué)及腦內(nèi)一氧化氮含量的影響

程為平,董升平,馬莉,趙吉諾,張洋

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,哈爾濱 150040)

帕金森病(PD)又稱震顫麻痹,是一種多發(fā)于中老年人的慢性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,病理特征為黑質(zhì)細(xì)胞變性壞死,腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的生成、代謝障礙[1-2],主要表現(xiàn)為震顫,肌肉僵直,運動活動-啟動困難和姿勢反射喪失等[3]。造成以多巴胺能系統(tǒng)與膽堿能系統(tǒng)為主的腦內(nèi)多個神經(jīng)遞質(zhì)之間的不平衡。左旋多巴類制劑為治療 PD的主要藥物[4],但長期應(yīng)用會導(dǎo)致療效遞減。為了探討中藥治療PD的療效和機(jī)制,我們采用 PD小鼠模型進(jìn)行以下研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 健康 10～11周齡 C57BL/6雄性小鼠 60只,體質(zhì)量(20±2)g,由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。室內(nèi)常溫下配方料喂養(yǎng),自由飲食水。

1.1.2 儀器 電熱恒溫水浴箱(RF-540型,江蘇);電動玻璃勻漿機(jī)(DY89-1型,寧波);分析振蕩器(FZQ-2型,江蘇);托盤式扭力天平(TN-100B型,上海);電動離心機(jī)(LD5-2型,北京);722光柵分光光度計(上海第二分析儀器廠)。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模方法 采用腹腔注射 MPTP的方法制備 PD動物模型。將 60只小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、中藥組及美多巴組。模型組、中藥組和美多巴組給予 1-甲基 -4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)腹腔注射(0.03mg/g體質(zhì)量),1次/d,連續(xù) 7 d制備PD小鼠模型;空白組給予 0.9%氯化鈉注射溶液腹腔注射。

1.2.2 治療方法 實驗第 8天開始,中藥組予補髓健腦方灌胃,0.1 ml/g(每毫升含有生藥量1.2mg),1次/d,連續(xù) 14 d;美多巴組給予美多巴懸濁液灌胃(0.12 mg/g體質(zhì)量),1次 /d,連續(xù) 14 d;空白組和模型組給予等量 0.9%氯化鈉注射溶液腹腔注射。

1.2.3 行為學(xué)測試方法 各組小鼠于實驗前 5天每日進(jìn)行 2次爬桿、懸掛行為訓(xùn)練。分別于實驗前1天(首次注射 MPTP前 1天),第 7天(注射藥物后1小時),第 14天和第 21天上午 10:00(針刺后1 h)進(jìn)行爬桿[5]和懸掛[6]實驗以檢測其肢體運動協(xié)調(diào)能力。

將一直徑為 2.5 cm的泡沫塑料小球固定于一根長 60 cm粗 1 cm的木桿頂端,木桿上纏 2層紗布以防打滑。將小鼠放到球頂,分別記錄小鼠爬完桿長的上半部分、下半部分及全長所需的時間。3 s內(nèi)完成上述某一動作記 3分;6 s內(nèi)完成記 2分;超過6 s記 1分 。

將小鼠雙前肢懸掛于一水平電線上,如小鼠用雙后肢抓住電線記 3分;僅用一只后肢抓住電線記 2分;兩只后肢均抓不住記 1分;小鼠跌落記為 0分。

1.2.4 腦內(nèi) NO含量的檢測 行為學(xué)測試后,將小鼠斷頭取腦,經(jīng)視交叉處冠狀切開,向后取約 3 mm厚腦組織,用冰 0.9%氯化鈉注射溶液漂洗后,濾紙拭干,稱重后加入 9倍冷 0.9%氯化鈉注射溶液。電動勻漿機(jī)中研磨成 10%勻漿,以 1 000～2 000 r/min離心 10 m in,取上清液,再以 8 000～1 0000 r/min離心 15 min,取上清液,分別按 NO試劑盒說明檢測其含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用 SPSS軟件,采用 t檢驗。

2 實驗結(jié)果

2.1 行為學(xué)實驗結(jié)果 實驗前一天觀察小鼠爬桿及懸掛行為,模型組、中藥組和美多巴組小鼠實驗評分分別與空白組相比,無差異(P＞0.05、P＞0.05、P＞0.05);實驗第 7天、第 14天和第 21天觀察模型組小鼠,其實驗評分明顯降低,分別與空白組相比差異顯著(P＜0.01、P＜0.05、P＜0.01),提示造模成功;實驗第 14天和第 21天中藥組和美多巴組小鼠實驗評分明顯升高,分別與模型組相比差異顯著(P＜0.05、P＜0.01),說明中藥對 PD小鼠有治療作用。實驗第 14天和第 21天中藥組與美多巴組小鼠懸掛實驗評分相比,無差異(P＞0.05、P＞0.05),見表 1,2。

表1 各組小鼠實驗前后爬桿實驗評分(±s,分)

表1 各組小鼠實驗前后爬桿實驗評分(±s,分)

注:與空白組比較,aP＜0.01,b P＜0.05;與模型組比較,c P＜0.05;與中藥組比較,d P＞0.05

組別 鼠數(shù)(只)實驗前 1天 第 7天 第 14天 第 21天空白組 15 6.50±1.15 6.67±1.21 6.61±0.98 6.56±0.96模型組 15 6.30±1.28 4.41±1.21a 5.24±1.20b 5.49±0.79b中藥組 15 6.71±1.13 4.78±0.21a 6.69±1.05c 6.82±1.20c美多巴組 15 6.79±1.24 4.67±0.21a 6.32±1.14cd 6.45±0.74cd

2.2 生化指標(biāo)檢測 模型組小鼠腦內(nèi) NO含量(6.62±0.49μmol/gprot)明顯增多,與空白組(3.36±0.40μmol/gprot)相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);中藥組(3.67±0.21μmol/gprot)與模型組相比,小鼠腦內(nèi)NO含量明顯減少(P＜0.01);美多巴組(3.25±0.54μmol/gprot)與模型組相比,小鼠腦內(nèi) NO含量明顯減少(P＜0.01);中藥組和美多巴組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 各組小鼠實驗前后懸掛實驗評分(±s,分)

表2 各組小鼠實驗前后懸掛實驗評分(±s,分)

注:與空白組比較,aP＜0.01,c P＜0.05;與模型組比較,d P＜0.01,e P＜0.05;與中藥組比較,b P＞0.05

組別 鼠數(shù)(只)實驗前 1天 第 7天 第 14天 第 21天空白組 15 2.05±0.74 2.09±0.89 1.99±0.83 1.97±0.75模型組 15 1.84±0.96 0.81±0.13a 0.94±0.27c 0.95±0.12a中藥組 15 2.06±1.01 0.89±0.26a 2.01±0.34d 2.03±0.48d美多巴組 15 2.21±0.85 0.71±0.25ab 1.94±0.29eb 2.07±0.71db

3 討論

3.1 中藥對 PD模型動物行為學(xué)的影響 運動障礙是帕金森病患者的主要臨床表現(xiàn),運動障礙往往同時伴隨運動協(xié)調(diào)能力降低及肌張力增高,包括運動不能、運動減少、運動遲緩。實驗中,我們采用爬竿和懸掛實驗檢測帕金森小鼠的運動和協(xié)調(diào)功能障礙。研究發(fā)現(xiàn)中藥能夠顯著縮短小鼠爬桿時間,增強(qiáng)小鼠附著能力,提示中藥能夠提高動物模型肢體運動和協(xié)調(diào)能力,推測其對 PD的癥狀具有改善作用。

3.2 中藥治療 PD的機(jī)制 帕金森病屬于中醫(yī)的顫證范疇[7],《醫(yī)學(xué)綱目》曰:“掉即顫振之謂也”并首先提出“顫振”曰“顫,搖也;振,動也”。古人對顫證病因觀察十分細(xì)致[8],本病屬于本虛標(biāo)實之證,本虛在肝腎陰虛,氣血不足,髓?？仗?。標(biāo)實為風(fēng),火,痰,瘀,上犯清空,腦神失司。綜上,組天元沖劑:肝筋虧虛,虛風(fēng)內(nèi)動則顫,陰血不足,筋脈失榮則痙。本方由首烏、黃精、天麻、葛根、元胡、當(dāng)歸和石斛等藥組成。其中天麻、葛根可熄風(fēng)止痙[9];元胡與當(dāng)歸相配行氣止痛;首烏與黃精相配可補髓榮筋,石斛可益智健腦。諸藥相伍共奏止顫熄風(fēng)、活血開竅之功。

PD的主要病理改變?yōu)橹心X黑質(zhì)致密部多巴胺(DA)能神經(jīng)元的進(jìn)行性變性壞死,目前認(rèn)為可能與自由基、氧化反應(yīng)增強(qiáng)等因素有關(guān),當(dāng)自由基無法正常被清除而在機(jī)體內(nèi)過度堆積后,就會引起脂質(zhì)過氧化等一系列損害反應(yīng),導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生[10]。NO也是一種自由基,其與超氧陰離子(O-2)結(jié)合形成氧化亞硝酸離子,后者可以使線粒體的呼吸功能受到抑制,并可能損傷 DA能神經(jīng)元或分解成 OH-自由基,產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用,使損傷進(jìn)一步加重[11]。

本實驗表明,中藥補髓健腦方可以降低 PD小鼠模型腦內(nèi) NO含量,從而改善自由基的代謝,減少神經(jīng)元的損傷和神經(jīng)毒性,減少其凋亡、壞死,進(jìn)而達(dá)到保護(hù)黑質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元,抗氧化應(yīng)激等目的,緩解PD的進(jìn)程。

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