PCR-DGGE技術在環(huán)境微型生物群落研究中的應用

吳 利, 余育和, 馮偉松

(1.合肥師范學院生命科學系,安徽合肥230061;2.中國科學院水生生物研究所,武漢430072)

PCR-DGGE技術在環(huán)境微型生物群落研究中的應用

吳 利1, 余育和2, 馮偉松2

(1.合肥師范學院生命科學系,安徽合肥230061;2.中國科學院水生生物研究所,武漢430072)

變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)具有可靠性強、重復性好、方便快捷等優(yōu)點,目前被廣泛地應用于環(huán)境微型生物群落多樣性和動態(tài)分析。本文對PCR-DGGE技術的基本原理和流程,圖譜的優(yōu)化過程和圖譜分析方法,及其在環(huán)境微型生物生態(tài)學中的應用進行了綜述,并對該技術自身存在的局限性和應用前景進行了評價。

PCR-DGGE;微型生物;群落

微型生物(microbiota)泛指需借助顯微鏡才能觀察到或觀察清楚的微小生物,主要包括細菌、真菌、單細胞藻類和原生動物,有時也包括小型的后生動物如輪形動物以及各種無脊椎動物的幼蟲和幼體等。微型生物分布在生態(tài)系統(tǒng)中各個層次的空間里并占據(jù)著各自的生態(tài)位,彼此之間通過十分復雜的相互聯(lián)系和相互作用而構成生態(tài)系統(tǒng)中一個特定的生物群落——微型生物群落(microbial community)[1-2]。

微型生物因個體十分微小,因此依據(jù)形態(tài)特征對微型生物進行物種鑒定是非常困難的,并且有些微型生物的物種形態(tài)鑒定甚至是不可能的,如細菌等。伴隨著分子生物學技術的發(fā)展,分子指紋技術逐漸成為解決某些分類困惑的重要手段,并可能成為跨越形態(tài)鑒定而連接DNA結構與物種構成的橋梁。變性梯度凝膠電泳(denatured gradient gel electrophoresis,DGGE)是由 Fischer和Lerman于1979年最先提出的用于檢測DNA突變的一種電泳技術[3]。它的分辨精度比瓊脂糖電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳更高,可以檢測到一個核苷酸水平的差異。1993年,Muyzer等[4]首先將DGGE應用到微型生物群落結構研究,并指出了這種技術在揭示自然界微型生物區(qū)系的遺傳多樣性具有獨特的優(yōu)越性。由于DGGE技術避免了分離純化培養(yǎng)所造成的分析上的誤差,通過指紋圖譜直接再現(xiàn)群落結構,目前已經(jīng)發(fā)展成為研究微型生物群落結構的主要分子生物學方法之一[5-6]。本文對PCR-DGGE技術的基本原理和流程,圖譜的優(yōu)化過程和圖譜分析方法,及其在環(huán)境微型生物生態(tài)學中的應用進行了綜述,并對該技術自身存在的局限性和應用前景進行了評價。

1 PCR-DGGE的基本原理與方法

1.1 PCR-DGGE基本原理

DNA分子雙螺旋結構是由氫鍵和堿基的疏水作用共同作用的結果。溫度、有機溶劑和p H等因素可以使氫鍵受到破壞,導致雙鏈變性為單鏈。DGGE技術檢測核酸序列是通過不同序列的DNA片段在各自相應的變性劑濃度下變性,發(fā)生空間構型的變化,導致電泳速度的急劇下降,最后在其相應的變性劑梯度位置停滯,經(jīng)過染色后可以在凝膠上呈現(xiàn)為分散的條帶。該技術可以分辨具有相同或相近分子量的目的片段序列差異,可以用于檢測單一堿基的變化和遺傳多樣性以及PCR擴增DNA片段的多態(tài)性[7]。該技術首先從復雜微型生物集合中提取基因組DNA,用特異性引物(如16S rRNA基因和18S rRNA基因)進行PCR擴增,混合的PCR產(chǎn)物在變性劑線性梯度變化的聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳,相同大小不同序列的DNA片段將停留在凝膠的不同位置,以達到分離混合 PCR產(chǎn)物的目的。

DGGE技術具有以下優(yōu)點:1)分辨率高,能夠檢測出只存在單堿基差異的突變個體;2)加樣量小, 1～5ng的DNA或RNA加樣量就可達到清晰的電泳分離效果;3)重復性好,電泳條件如溫度、時間等易于控制,可保證電泳的重現(xiàn)性和結果的重復性;4)操作簡便、快速,可以同時檢測多個樣品;5)可以從凝膠中切下譜帶,然后測序分析來揭示群落成員系統(tǒng)發(fā)育的從屬關系,進一步可以用類群特異探針同群落圖譜雜交,檢測出特異種群的存在。DGGE技術具有以下缺陷:1)其檢測的DNA片段最適長度為500bp,超出此范圍的片段DGGE分辨率會下降;2)PCR擴增所需 GC堿基對含量至少達40bp; 3)如果電泳的條件不適宜,不能保證將有一定序列差異的DNA片段完全分開,會出現(xiàn)序列不同的DNA遷移在同一位置的現(xiàn)象。DGGE的條帶數(shù)不能完全精確地反映被分析的混合物中不同序列的數(shù)量。有時一條DGGE帶可能代表幾種物種,從而導致自然群落中生物的數(shù)量被低估,或者可能不同的幾條DGGE帶代表同一物種,從而導致高估自然群落中生物的數(shù)量;4)數(shù)量較少的物種DNA可能得不到PCR擴增。

1.2 PCR-DGGE流程

PCR-DGGE的基本流程是:(1)首先從各種不同環(huán)境中取得環(huán)境樣品;(2)進行環(huán)境樣品宏基因組DNA的提取及純化;(3)通過聚合酶連鎖反應(PCR)將提取的宏基因組DNA中的特定序列如16S rDNA和18S rDNA進行擴增;(4)進行預實驗,優(yōu)化DGGE條件;(5)制膠;(6)擴增產(chǎn)物利用DGGE進行分離;(7)DGGE圖譜分析;(8)對DGGE條帶進行測序并鑒定分析,鑒定群落成員。

2 PCR-DGGE圖譜的系統(tǒng)優(yōu)化

利用DGGE分析復雜環(huán)境樣品時,獲得高分辨率的圖譜是重要的前提條件。影響DGGE分辨率的因素很多。如DNA提取效果、PCR擴增效果、電泳時間、電泳溫度、凝膠濃度、變性劑梯度、染色方法等。在DGGE的操作過程的每一個環(huán)節(jié)都會對后續(xù)分析產(chǎn)生影響并導致誤差的產(chǎn)生,因此必須對全部環(huán)節(jié)進行優(yōu)化才能獲得DGGE圖譜的最大分辨率。

2.1 環(huán)境宏基因組DNA提取方法

對環(huán)境樣品宏基因組DNA直接提取可以保證所獲得的樣品具有一定的代表性,克服了傳統(tǒng)微型生物培養(yǎng)技術的局限性。環(huán)境樣品宏基因組DNA的提取和純化是PCR-DGGE指紋技術的前提。在提取環(huán)境樣品宏基因組DNA時,同時被提取的還有樣品中存在的雜質(zhì),這些雜質(zhì)會影響PCR過程中酶的活性,從而影響實驗結果的真實性及穩(wěn)定性,因此獲得較高純度的環(huán)境樣品宏基因組DNA是至關重要的。目前主要是采用物理或化學方法將細胞中的DNA游離釋放出來,然后進行直接提取。物理方法包括研磨、機械破碎、超聲波破碎法等,而化學法包括SDS裂解和溶菌酶法等[8]。

2.2 PCR擴增優(yōu)化

PCR擴增是DGGE技術中至關重要的步驟,在PCR擴增中,引物的選擇、擴增程序和PCR產(chǎn)物的質(zhì)量都會造成群落結構的分析偏差。在分析微型生物群落時,通常采用原核生物16S rDNA或真核生物18S rDNA中的保守區(qū)作為引物進行PCR反應。然而在分析不同樣品時通常需要選擇適宜的引物,否則達不到預期的效果。擴增片段大小對DGGE分析影響也較大,200bp左右的片段分離條帶數(shù)最多、效果較好,但是在系統(tǒng)發(fā)育分析中往往是分類信息缺乏。450～500bp左右片段的分類信息相對更為豐富。常規(guī)的DGGE電泳技術對于長度超過500bp的DNA片段的序列變化情況,只能有50%的檢出率[9]。應用“GC夾板”技術可以提高檢出率[9-10]。由于DNA分子中的 G、C堿基對要比A、T堿基對結合得牢固,因此G、C含量高的區(qū)域具有較高的解鏈溫度?；谶@一原理,通常在DNA片段上連接一段長度為30～50bp富含 GC的核苷酸序列(GC夾板或GC發(fā)卡結構)附加到雙鏈的一端以形成一個人工高溫解鏈區(qū),這樣可以分辨相差一個堿基的序列。羅海峰等[11]在研究土壤微型生物多樣性中用到 GC發(fā)卡結構的效應,結果表明,含GC發(fā)卡結構的PCR擴增產(chǎn)物在DGGE中能夠得到很好的分離,而無GC發(fā)卡結構的PCR產(chǎn)物則不能在DGGE中獲得較好分離。

2.3 變性劑梯度的確定

聚丙烯酰胺凝膠濃度的確定取決于基因片段的大小,片段大小在200bp左右時,可用8%的凝膠,當片段在500bp時,可用6%的凝膠。根據(jù)變性劑梯度方向的不同,DGGE可分為:(1)垂直DGGE,主要用于試驗決定分離野生型和突變型的最佳變性劑梯度范圍;(2)平行DGGE,其變性劑的梯度同電場的方向平行,主要用于解鏈范圍明確的DNA片段的檢測。變性劑的選擇是取決于環(huán)境樣品的Tm值,復雜環(huán)境樣品Tm差異較大,要分辨較多環(huán)境樣品,變性劑梯度范圍則較寬。一般用垂直變性梯度實驗來選擇所研究片段的解鏈性質(zhì)、變性劑濃度梯度。采用垂直變性梯度電泳后經(jīng)染色處理,片段經(jīng)凝膠成像后呈現(xiàn)出一條清晰的“S”型曲線,變性劑梯度范圍應選在垂直實驗曲線斜率較大的部分[7-8]。

2.4 電泳溫度及時間的確定

電泳的溫度低于待測DNA片段解鏈區(qū)域Tm值。對絕大多數(shù)天然的DNA片段50～65°C比較適合。但是對于復雜的未知環(huán)境樣品來說,解鏈溫度通常是比較復雜的,因此通常是在60℃左右進行優(yōu)化。在水平電泳分析樣品之前,先要優(yōu)化確定電泳所用的時間。一般采用時間間歇的方法,即每隔一定時間加一次樣品,從而使樣品的電泳時間有一個梯度。根據(jù)這個結果確定最佳的電泳時間[7-8]。電泳時間往往受樣品的片段大小、凝膠濃度、變性劑梯度、電泳時的電壓等因素的影響。因此如果改變了這些參數(shù),電泳時間必須重新優(yōu)化和調(diào)整。

2.5 染色方法的選擇

DGGE電泳后需要進行核酸染色才能呈現(xiàn)出指紋圖譜,最常用的是溴化乙錠(Ethidium bromide,EB)染色法、熒光染料染色法(SYBR Gold和SYBR Green I)[12]和銀染法。相比而言,溴化乙錠價格便宜,但毒性較大,且靈敏度不高;銀染法靈敏度最高,但無法進行后續(xù)的雜交分析,但是銀染法仍然是比較完善的染色方法,并被研究者廣泛使用;熒光染料染色法背景色低,可以更好地顯示DGGE條帶,但是價格較高。通常可以根據(jù)研究的目和實際情況選擇適宜的染色方法。

2.6 DGGE圖譜的統(tǒng)計分析

應用統(tǒng)計學方法對DGGE圖譜進行歸納總結,從而解釋環(huán)境微型生物群落結構和演替規(guī)律。目前可運用凝膠分析軟件如Quantity One對DGGE圖譜中的條帶位置和強度進行簡單分析。但是條帶的強度不能代表細菌的數(shù)量,只能根據(jù)條帶的強度表示相對的趨勢。排序(Ordination)和分類(Classification)是群落生態(tài)學中兩種主要的多變量分析方法,因此可以應用多元變量的統(tǒng)計學方法分析DGGE圖譜。目前,對DGGE圖譜分析應用較多的是非加權算術平均法(UPGMA)[13-18],多維尺度分析(Multidimensional scaling,MDS)[17,19-20]、主成分 分 析 (Principal - component analysis, PCA)[17,21-22]和典型對應分析(canonical correspondence analysis,CCA)[23-27]。

2.7 DGGE圖譜的核酸序列分析

為了解微型生物群落結構和系統(tǒng)進化關系,通常需要切取DGGE圖譜中的優(yōu)勢條帶,獲得序列信息。一個條帶經(jīng)常含有多種序列,所以在切取條帶重新擴增后需要對PCR產(chǎn)物進行克隆,然后測序。從一個切取條帶的克隆文庫中隨機挑選一些克隆,然后用帶GC夾的引物擴增,每個克隆的PCR產(chǎn)物再進行DGGE分析,檢查與切取條帶的遷移位置是否一致,選擇一致遷移位置的克隆進行測序分析。如果條帶過于復雜,則需要進一步提高DGGE的分離效果。也可以選擇種屬特異引物選擇性擴增樣品[28-29]。在獲得條帶的序列信息后在 GenBank中進行比對分析,搜索最相似的序列。將全部序列比對齊后構建系統(tǒng)進化樹,得到待測樣品的系統(tǒng)進化或分類信息。

3 PCR-DGGE在環(huán)境微型生物生態(tài)學中的應用

PCR-DGGE技術解決了傳統(tǒng)方法的片面性,在分析各種環(huán)境微型生物群落多樣性和動態(tài)性方面得到了廣泛應用。Eichner等[30]和 Watanabe等[31]運用DGGE研究了活性污泥中細菌群落結構的多樣性。Simpson等[32]和Zoetendal等[33]運用DGGE研究了人體和動物腸道微型生物群落的多樣性。Ferris等[34]運用DGGE對美國黃石公園一溫泉中不同溫度菌藻系中的細菌多樣性進行比較,發(fā)現(xiàn)從相同溫度采集的樣品的DGGE條帶相同,而從不同溫度得到的樣品的DGGE條帶差異很大。趙興青等[35]采用PCR-DGGE比較南京市玄武湖、莫愁湖和太湖不同位置的表層沉積物微型生物群落結構,研究結果表明玄武湖和莫愁湖表層沉積物中大約有20種優(yōu)勢菌群,且同一湖泊不同采樣點DGGE圖譜的差異性不大,細菌群落結構具有較高的相似性,而與太湖沉積物樣品的DGGE條帶數(shù)目和位置具有明顯差異性,且太湖不同采樣點的DGGE圖譜也有較大的差異性。Foti等[36]運用PCR-DGGE研究了俄羅斯阿爾泰邊疆區(qū)的庫倫達草原的四個不同鹽量梯度堿湖中硫酸鹽還原菌(sulfate-reducing bacteria,SRB)的多樣性。Teske等[37]采用 PCRDGGE法分析了硫酸鹽還原菌時空分布的變化。Celussi與Cataletto[21]運用PCR-DGGE對北部亞得里亞海的里雅斯特灣浮游細菌群落結構的多樣性進行了每月的定期檢測。王峰等[38]應用 PCRDGGE分析了傳統(tǒng)城市污水處理工藝和化學生物絮凝處理工藝反應池活性污泥樣品在菌群結構上的差別。Sandaa等[39]研究了不同污染程度土壤中的重金屬對古菌群落的影響。Da Mota等[40]用 PCR -DGGE研究增施石灰對玉米根際土壤和非根際土壤微型生物群落結構的影響。李友發(fā)等[41]利用PCR-DGGE對福建省6個不同地區(qū)12個取樣點的稻田土壤進行細菌群落結構分析。王君等[42]采用PCR-DGGE對高溫油藏的微型生物群落進行了多樣性分析,并將得到的信息用于指導油藏微型生物的分離。Fujimoto等[43]和Zijinge等[44]同時將DGGE作為一種新的研究方法應用于口腔微型生物的研究。目前,絕大部分研究都是通過擴增細菌或古細菌的16S rRNA基因來研究各生態(tài)系統(tǒng)中的細菌或古細菌群落多樣性。近年來,許多研究者運用真核生物的通用引物擴增18S rRNA基因研究真核生物群落遺傳多樣性。龍良鯤等[45]分別從叢枝菌根(AM)真菌的單孢、宿主植物根系及土壤樣品中提取DNA,對AM真菌的18S rDNA中NS31/ Glol區(qū)進行Nested-PCR特異性擴增,表明Nested-PCR能很好地以微量DNA為模板擴增出目標產(chǎn)物;對擴增產(chǎn)物進行DGGE電泳,3種樣品表現(xiàn)出不同的DGGE指紋圖譜特征。Díez等[20]用DGGE研究海洋中微微型真核生物群落的多樣性,真核生物特異性引物PCR擴增18S rDNA片段的DGGE指紋用于比較不同時間從地中海西南部一觀測站采集不同深度樣品的微微型真核生物的多樣性。PCR擴增18S rDNA片段的DGGE被用來研究海岸沙丘區(qū)固沙植物的真菌感染,切下DGGE帶與真菌分離物的DNA序列比較揭示了未知的多樣性[46]。用18S rDNA片段的DGGE比較荷蘭淺淡水湖系不同水體真核生物的多樣性[47]。上述研究均是運用PCR-DGGE技術分別研究原核生物和真核生物的遺傳多樣性,至今只有少數(shù)報道運用PCR-DGGE研究浮游生物群落(包括原核生物和真核生物)的遺傳多樣性。Savin等[48]首次運用PCR-DGGE研究了浮游生物群落遺傳多樣性的變化。此后,PCR-DGGE被運用于研究不同環(huán)境條件下(如湖泊[17,23,24,27]、水庫[25]、室內(nèi)模擬生態(tài)系統(tǒng)[26]、人工模擬試驗湖[13]、廢水處理廠[16])浮游生物群落遺傳多樣性,并探討了浮游生物群落遺傳多樣性與物種組成及理化因子之間的關系。

4 PCR-DGGE在微型生物生態(tài)學中的應用前景

PCR-DGGE除具有可靠、可重復、快速、容易操作等特點外,還能直接顯示微型生物群落中優(yōu)勢組成成分,并可以同時對多個環(huán)境樣品進行分析從而使之非常適合調(diào)查環(huán)境微型生物群落的時空變化,而且可以通過序列分析鑒定群落成員,因而該技術已發(fā)展成為分析復雜環(huán)境中微型生物群落的多樣性及動態(tài)變化的主要指紋技術。目前,利用功能基因作為分子標記物研究代謝活性已成為分子生態(tài)學的一個新方向[49-51],可利用PCR-DGGE分析環(huán)境微型生物群落功能菌的功能基因,如可容性甲烷加單氧酶羥化酶基因(mmoX)和氨加單氧酶a-亞單位基因(amoA)從而反映功能菌的變化。為減少各種不同技術的偏見和限制性,結合PCR-DGGE和其它分子指紋技術更實際地揭示微型生物群落的結構和功能。

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Application of PCR-DGGE in Study of Microbial Community

WU Li1, YU Yu-he2, FENG Wei-song2

(1.Department of L if e Sciences,Hef ei N ormal University,Hef ei230061,China;2.Key L aboratory of Biodiversity and Conservation of A quatic Organisms,Institute ofHy drobiology, Chinese Academy of Sciences,W uhan430072,China)

PCR-denaturing gradient gel electrophoresis(PCR-DGGE)has the advantages of high reliability, good repetition,and easy operation.Currently,it has been widely used in the study of diversity and dynamics of microbial communities.This paper introduces the principle and procedure of PCR-DGGE,discusses the optimization and statistical analysis of PCR-DGGE profile,reviews its application in the study of environmental microbial ecology,and analyzes its limitations and potential application.

PCR-DGGE;microbiota;community

Q145

B

1674-2273(2010)06-0103-06

2010-06-02

吳利(1981-),女,安徽鳳臺人,合肥師范學院生命科學系教師,理學博士,主要從事浮游生物生態(tài)學研究。