細(xì)菌S-layer蛋白的研究新進(jìn)展

細(xì)胞壁在原核生物的生命活動(dòng)中起著重要的作用，而細(xì)胞壁最外層結(jié)構(gòu)的多樣性反映了生物體對(duì)特定生態(tài)環(huán)境的適應(yīng)。經(jīng)過(guò)30多年的研究發(fā)現(xiàn)，古細(xì)菌及細(xì)菌的外表面有一個(gè)共同的結(jié)構(gòu)即S-layer(Surface layer)，是由蛋白質(zhì)成分的亞單元組成的一種單分子二維晶格結(jié)構(gòu)，幾乎存在于所有有壁細(xì)菌及古細(xì)菌中[1]。形態(tài)學(xué)、化學(xué)及形態(tài)發(fā)生學(xué)研究表明，S-layer是進(jìn)化中形成的一種最基本的生物膜結(jié)構(gòu)[2]；S-layer 蛋白也是細(xì)胞內(nèi)豐度最高的蛋白之一，可高達(dá)細(xì)菌總蛋白的15%左右[3]。S-layer 蛋白可以在體外自發(fā)組裝成重復(fù)多孔的晶格結(jié)構(gòu)，這一特性使S-layer蛋白在離子選擇性結(jié)合基質(zhì)、微載體、生物傳感器、疫苗、組織再生中的生物吸附系統(tǒng)等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。作者在此對(duì)近年來(lái)細(xì)菌S-layer蛋白的研究及應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1 S-layer 的起源、結(jié)構(gòu)及化學(xué)特性

經(jīng)過(guò)近半個(gè)世紀(jì)的研究，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)上百種主要的細(xì)菌類群都具有S-layer，包括藍(lán)藻和古細(xì)菌。據(jù)統(tǒng)計(jì)[4]，有200種真細(xì)菌及79種古細(xì)菌具有S-layer，這個(gè)數(shù)字還在不斷增加。

在不同的細(xì)菌中，S-layer結(jié)合的部位也不一樣。在革蘭氏陽(yáng)性菌及古細(xì)菌中，S-layer亞單元與肽聚糖層或偽肽聚糖層連接；在革蘭氏陰性菌中，與細(xì)胞外膜的脂多糖層偶連；而在大多數(shù)缺少明顯細(xì)胞壁的古細(xì)菌中，S-layer是唯一的細(xì)胞壁組分，與細(xì)胞質(zhì)膜緊密相連[4,5]。

S-layer大多是由單一的蛋白質(zhì)或糖蛋白構(gòu)成的二維晶格結(jié)構(gòu)，表觀分子量介于40 000～200 000之間。因?yàn)樗凶詈?jiǎn)單的重復(fù)性分子結(jié)構(gòu)，因而被認(rèn)為是進(jìn)化中形成的最基本的膜結(jié)構(gòu)。

與真核生物的脂質(zhì)雙層膜不同的是，S-layer蛋白只有一種蛋白組成，而且呈周期性排列。S-layer蛋白形成的亞單元在溶液中或者合適的界面上可以重新組裝成二維晶格結(jié)構(gòu)，而界面的凈電荷、疏水性及特定的亞單元間的連接特性都會(huì)影響到S-layer亞單元組裝的方向和方式[5,6]。

2 S-layer蛋白的研究進(jìn)展

近年來(lái)陸續(xù)對(duì)40多種S-layer蛋白基因進(jìn)行了克隆和測(cè)序，發(fā)現(xiàn)S-layer蛋白有類似的結(jié)構(gòu)組成。大多數(shù)S-layer蛋白由弱酸性的蛋白(或糖蛋白)組成，等電點(diǎn)介于3～6之間，少數(shù)幾種細(xì)菌如Methanothermusfervidus及幾種乳酸桿菌的S-layer蛋白的等電點(diǎn)分別是8.4和9～10。S-layer蛋白通常含有大量的谷氨酸和天冬氨酸(總摩爾分?jǐn)?shù)約為15%)，不含或僅含少量的硫氨基酸。圓二色性檢測(cè)及氨基酸分析表明，40%的氨基酸殘基形成β-折疊，20%形成α-螺旋結(jié)構(gòu)[7～9]。

許多古細(xì)菌和某些細(xì)菌還能糖基化S-layer蛋白，糖基部分是革蘭氏陰性菌的O-抗原多糖的主要組分。典型的糖鏈由20～50個(gè)含有中性己糖、戊糖、庚糖及氨基糖的相同重復(fù)元組成。革蘭氏陽(yáng)性菌S-layer蛋白的糖鏈與革蘭氏陰性菌的脂多糖更相似，而不同于真核生物的碳鏈。S-layer糖蛋白的核心寡糖由2～4個(gè)糖基組成，大多通過(guò)O-糖苷鍵將碳鏈與蛋白部分連接。革蘭氏陽(yáng)性菌的S-layer糖蛋白有2～4個(gè)糖基化位點(diǎn)，而古細(xì)菌中有高達(dá)25個(gè)糖基化位點(diǎn)，而且主要是N-糖苷鍵連接[10,11]。

為了與細(xì)胞的生長(zhǎng)一致以覆蓋整個(gè)細(xì)胞，S-layer基因具有強(qiáng)啟動(dòng)子。Boot等[12]的研究表明，L.acidophilus的S-layer基因啟動(dòng)子效率是乳酸脫氫酶基因啟動(dòng)子的2倍，而后者被認(rèn)為是細(xì)菌中最強(qiáng)的啟動(dòng)子之一。L.brovis的S-layer蛋白表達(dá)需要2個(gè)啟動(dòng)子，其中一個(gè)離起始密碼子較近，在細(xì)胞生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期及穩(wěn)定期早期表達(dá)，另一個(gè)在細(xì)胞生長(zhǎng)的其它時(shí)期表達(dá)。B.brevis的S-layer蛋白表達(dá)甚至需要3個(gè)啟動(dòng)子。

大多數(shù)S-layer蛋白的分泌是通過(guò)信號(hào)肽途徑，但是Aeromonassalmonicida、C.fetus和C.crescentus則采用不同的分泌途徑[13]，如通過(guò)ABC(ATP-binding cassette)轉(zhuǎn)運(yùn)體或I型轉(zhuǎn)運(yùn)體。S-layer蛋白也存在一些翻譯后的修飾，包括氨基端或羧基端的切除、氨基酸殘基的磷酸化和糖基化等。

3 S-layer的功能

S-layer通常是復(fù)雜的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的一部分，因此功能上也不是獨(dú)立或單一的。目前對(duì)S-layer的功能了解并不多，很多方面還處于假說(shuō)階段，缺乏足夠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。

古細(xì)菌及細(xì)菌S-layer的功能主要有以下3點(diǎn)[14,15]：(1)作為保護(hù)衣、超濾分子篩、分子及離子陷阱；(2)作為細(xì)胞粘連和表面識(shí)別的基質(zhì)；(3)在革蘭氏陰性的古細(xì)菌中作為決定細(xì)胞形狀的骨架。

由于S-layer也存在于人類和動(dòng)物的多種病原體中，所以研究者對(duì)Aeromonassalmonicida、Aeromonashydrophila和C.fetus等[16]病原微生物的S-layer給予了特別的關(guān)注，這些研究將會(huì)闡明S-layer作為毒力因子方面的意義。

4 S-layer蛋白的應(yīng)用

4.1 作為超濾膜

因?yàn)镾-layer是由單個(gè)蛋白或糖蛋白組成的周期性排列結(jié)構(gòu)，S-layer蛋白的每個(gè)分子單元都可以在亞納米水平表現(xiàn)出相同的生化特性，形成大小和形態(tài)相同的微孔，許多重要的功能基團(tuán)(如羥基、氨基或羧基等)都以特定的位置和方向在微孔內(nèi)排列，因而可通過(guò)化學(xué)修飾以獲得特定的S-layer超濾膜，這種超濾膜具有精確分子量并帶有不同電荷特性或親水性及疏水性。通過(guò)使用特定孔徑大小及生化表面特性的S-layer超濾膜，就可以確定超濾層的微孔大小與凈電荷的相關(guān)性、被吸附蛋白的分子特性(直徑、凈電荷等)及由于被吸附到超濾層表面所引起的流量損失等[17]。

4.2 作為固定功能分子的基質(zhì)

鑒于S-layer蛋白晶格中每個(gè)分子的均勻性及其亞單元可以重新聚合的特性，可以使之成為特異性結(jié)合不同大小功能分子的理想載體。無(wú)論是在溶液中或是附著于支持物上，S-layer蛋白均可作為固定基質(zhì)以可再生的方式結(jié)合單層的功能分子(如抗體、配體、半抗原、免疫原、酶等)。對(duì)于糖基化的S-layer蛋白，蛋白質(zhì)部分及糖基殘基都可以用來(lái)固定不同的大分子。利用高分辨率的電子顯微鏡觀察到這些被固定的大分子可以反映S-layer晶格的重復(fù)方式。這一技術(shù)可用于生物分析傳感器、免疫測(cè)定及結(jié)合疫苗等方面[14,18]。

與通常所用的由無(wú)定形多聚體組成的有孔支持物相比，S-layer蛋白作為固定基質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)是：在pH值7.0左右時(shí)，S-layer蛋白對(duì)大分子的非特異性吸附非常低，幾乎沒(méi)有背景反應(yīng)；另外，單層酶、配體或抗體在S-layer表面上的有序排列可以避免一些自由擴(kuò)散反應(yīng)。在硅板上重新組裝的S-layer蛋白可以用深度超紫外放射定型，作為控制生物礦化的基質(zhì)；表面被金屬氧化的S-layer蛋白可以用作納米材料制成的半引導(dǎo)器表面的模具，用以開發(fā)新的光電材料和設(shè)備。

4.3 作為功能脂膜的支持物

如何獲得在宏觀水平上具有特定功能特性的再生生物膜，無(wú)論對(duì)于基礎(chǔ)研究者還是應(yīng)用研究者都極富吸引力。但是有功能的脂膜都是動(dòng)態(tài)的流動(dòng)結(jié)構(gòu)，生命期短且穩(wěn)定性差，從而妨礙了它們的結(jié)構(gòu)功能和應(yīng)用潛力的長(zhǎng)周期研究。無(wú)支持物的脂膜瓦解的主要原因在于脂分子的橫向擺動(dòng)性。在極端環(huán)境條件下(如低pH值、高鹽、高溫)生存的古細(xì)菌，其細(xì)胞壁由S-layer及相連的細(xì)胞質(zhì)膜組成，因此，可以利用S-layer晶格結(jié)構(gòu)來(lái)穩(wěn)定大量再生的功能脂膜。通過(guò)將分離的S-layer亞單元注入Langmuir-Blodgett (LB)脂膜的面下相，就可在氣-水界面上獲得排列在脂膜上的、大量連貫的單分子S-layer晶格結(jié)構(gòu)[19]。這些S-layer支持的LB脂膜可以覆蓋許多微孔，孔徑可達(dá)幾個(gè)微米，并且在后續(xù)的處理中依然保持結(jié)構(gòu)的完整性。這項(xiàng)技術(shù)可以用在多個(gè)領(lǐng)域，如診斷學(xué)、傳感器技術(shù)、電子或光學(xué)設(shè)備等。

4.4 融合基因的表面展示

S-layer蛋白的一些結(jié)構(gòu)域允許外源抗原決定簇的插入而不影響其組裝成規(guī)則的晶格結(jié)構(gòu)，如利用幾種乳酸菌的S-layer可將幾種具生物活性的抗原決定簇進(jìn)行表面展示。將SLP SbsA與nontypeableHaemophilusinfluenzae(NTHi)的抗原——其外膜蛋白Omp26融合，在老鼠中可產(chǎn)生Omp26特異性的抗體[20]。

Bohle等[21]將白樺花粉的主要過(guò)敏原Bet v 1與B.stearothermophilusATCC 12980的S-layer蛋白SbsC的C-端相融合產(chǎn)生的融合蛋白不僅具備有功能的過(guò)敏原，還能自組裝成單分子的晶格結(jié)構(gòu)，將該融合蛋白作為疫苗可以安全高效地用于預(yù)防I型過(guò)敏癥。Avall等[22]將Lactobacillus的S-layer蛋白的每一段親水性結(jié)構(gòu)域都成功地與6個(gè)組氨酸的多肽融合表達(dá)，并使宿主菌細(xì)胞表面產(chǎn)生結(jié)合Ni2+和Cd2+的能力。

Pleschberger將BacillussphaericusCCM 2177的SLP與前列腺特異性抗體重鏈的一個(gè)易變結(jié)構(gòu)域序列相融合，所產(chǎn)生的融合蛋白在包被有烴硫基化的次級(jí)細(xì)胞壁多聚物的芯片上重新聚合結(jié)晶。這種高密度、具有特定配基間距的感受層可以用作表面胞質(zhì)基因諧振生物芯片，以特異性地檢測(cè)前列腺特異性抗體。

蛋白A的B結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合IgG的Fc部分，將2個(gè)拷貝的人工合成的B結(jié)構(gòu)域的類似物Z-結(jié)構(gòu)域與來(lái)自BacillussphaericusCCM 2177的SLP SbpA融合，產(chǎn)生的融合蛋白不但可以再結(jié)晶，對(duì)IgG的吸附能力也比商用的免疫吸附劑高20倍。SbpA與增強(qiáng)的綠色熒光蛋白融合也可同時(shí)保持兩種蛋白的特性，而被這種融合蛋白包被的脂質(zhì)體經(jīng)過(guò)2 h的孵育還可以進(jìn)入HeLa細(xì)胞[23]。

5 結(jié)語(yǔ)

在過(guò)去的10年中，對(duì)S-layer的研究取得了巨大的進(jìn)展，20世紀(jì)70年代早期，全世界只有不到5個(gè)實(shí)驗(yàn)室在關(guān)注S-layer，現(xiàn)在已有上百位研究者在300多種原核生物中發(fā)現(xiàn)了S-layer。通過(guò)對(duì)S-layer的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、組裝、定位和功能進(jìn)行深入的研究，發(fā)現(xiàn)這種在亞納米水平上形成的具有相同理化性質(zhì)的單分子多孔蛋白晶體在納米技術(shù)上具有廣闊的應(yīng)用前景，而可與外源多肽融合表達(dá)并在細(xì)胞表面展示為有功能的融合蛋白的特性更為納米生物技術(shù)開辟了新的領(lǐng)域。S-layer蛋白能在硅板上重新組裝成連續(xù)的單層結(jié)構(gòu)，并可以用深度超紫外激光放射固定，利用這一特點(diǎn)可將其用作有功能表面、已固定的仿生膜和可控制的生物礦化中的基質(zhì)。隨著研究的深入，S-layer蛋白的應(yīng)用會(huì)越來(lái)越多。

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