利用噬菌體展示技術(shù)研究功能基因組和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用——與酵母雙雜交方法比較

張佳娣，石屹峰

利用噬菌體展示技術(shù)研究功能基因組和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用——與酵母雙雜交方法比較

張佳娣，石屹峰

近年來(lái)基因組測(cè)序工作已揭示了數(shù)以萬(wàn)計(jì)的新基因，但是這些基因序列的價(jià)值只有當(dāng)這些數(shù)據(jù)被翻譯成蛋白質(zhì)功能的時(shí)候才能被了解。而蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用構(gòu)成了細(xì)胞生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)的一個(gè)主要組成部分，不僅可以從分子水平揭示蛋白質(zhì)的功能，而且為我們更好地理解生命過(guò)程、疾病機(jī)制和新藥開(kāi)發(fā)等提供了一個(gè)很好的基礎(chǔ)。當(dāng)前隨著人類(lèi)基因組和眾多生物物種全基因組測(cè)序的完成，功能基因組學(xué)（functional genomics）成為研究的主流，它是對(duì)基因組中包含的全部基因及其所翻譯的蛋白質(zhì)的功能加以解讀和描述，尤其是大量未知基因的功能及其對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的功能。在研究功能基因組方面已有許多生物化學(xué)和生物物理方法，其中噬菌體展示（phage display technology，PDT）和酵母雙雜交（yeast two-hybrid system，Y2H）是比較成熟的生物技術(shù)。噬菌體展示技術(shù)誕生于 1985 年，在抗體庫(kù)展示方面取得了巨大的成功，也被用于研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和未知基因克隆等多個(gè)分子生物學(xué)領(lǐng)域[1]。酵母雙雜交方法誕生于 1989 年，它被廣泛用于研究功能基因組和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，但是噬菌體展示技術(shù)在研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用方面具有一些獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[2]。本文綜述了噬菌體展示技術(shù)在克隆功能基因和研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用方面的最新進(jìn)展，同時(shí)將噬菌體展示技術(shù)與酵母雙雜交方法進(jìn)行了比較。

1 噬菌體展示技術(shù)與酵母雙雜交方法的比較

噬菌體展示技術(shù)是將外源蛋白或多肽的 DNA 序列插入到噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置，使外源基因隨外殼蛋白的表達(dá)而表達(dá)，同時(shí)，外源蛋白隨噬菌體的重新組裝而展示到噬菌體表面[3]。通過(guò)體外親和（綁定）靶分子篩選到的噬菌體克隆經(jīng)過(guò)下一輪擴(kuò)增而富集。該技術(shù)的主要特點(diǎn)是展示的多肽或蛋白質(zhì)與其包含在噬菌體內(nèi)部的基因相連接，具有基因型與表現(xiàn)型相一致的特征，因而可以快速準(zhǔn)確地對(duì)篩選出的結(jié)合肽或結(jié)合蛋白的基因序列進(jìn)行分析。由于噬菌體肽庫(kù)可以在大腸桿菌中進(jìn)行不斷擴(kuò)增，因此保證了淘選的連續(xù)性，為篩選出親和力和選擇性較高的肽或蛋白質(zhì)提供了極大的可能。

酵母雙雜交作為發(fā)現(xiàn)和研究活細(xì)胞體內(nèi)的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的方法是在真核模式生物酵母中進(jìn)行的，其原理是利用酵母轉(zhuǎn)錄因子 GAL4 蛋白結(jié)構(gòu)上組件式的性質(zhì)，即 GAL4 由兩個(gè)結(jié)構(gòu)上可以分開(kāi)、功能上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域（domain）構(gòu)成，其中有 DNA 結(jié)合功能域（DNA binding domain，DNA-BD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activation domain，AD）。這兩個(gè)結(jié)合域?qū)⑺鼈兎珠_(kāi)時(shí)仍分別具有功能，但不能激活轉(zhuǎn)錄，只有當(dāng)被分開(kāi)的兩者通過(guò)適當(dāng)?shù)耐緩皆诳臻g上較為接近時(shí)，才能重新呈現(xiàn)完整的 GAL4 轉(zhuǎn)錄因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence，UAS）的啟動(dòng)子，使下游基因得到轉(zhuǎn)錄。當(dāng)我們將已知蛋白作為誘餌（Bait），從 cDNA 基因文庫(kù)中篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白質(zhì)時(shí)，將編碼已知蛋白（誘餌蛋白）的基因與BD 基因融合（BD-Bait），編碼未知蛋白（捕獲物，Prey）的基因與 AD 基因融合（AD-Prey），如果 BD-Bait 和AD-Prey 共表達(dá)于宿主細(xì)胞中能發(fā)生相互作用，會(huì)使 AD與 BD 形成一個(gè)完整的轉(zhuǎn)錄激活因子，并激活相應(yīng)的報(bào)告基因表達(dá)。通過(guò)對(duì)報(bào)告基因表型的測(cè)定，可以很容易地知道待測(cè)蛋白 Prey 是否與已知蛋白 Bait 發(fā)生了相互作用。如果將 Prey 換成基因文庫(kù)，即可直接從基因文庫(kù)中篩選到能與 Bait 相互作用蛋白的 DNA 序列。因此，酵母雙雜交技術(shù)也成為研究未知基因與已知基因之間功能相關(guān)的主要方法[4]。

噬菌體展示技術(shù)與酵母雙雜交技術(shù)應(yīng)用于功能基因篩選和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究時(shí)分別具有各自的特點(diǎn)：①序列多樣性：噬菌體展示技術(shù)與酵母雙雜交技術(shù)相比展示的序列多樣性更大，噬菌體展示技術(shù)能在 109個(gè)克隆中篩選出一個(gè)，而酵母只能在 106個(gè)克隆中篩選出一個(gè)，因而篩選功能基因更敏感，在對(duì)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的作圖方面更具有優(yōu)勢(shì)[2,5]；②誘餌蛋白（靶分子）：對(duì)于整個(gè)基因組的大規(guī)模蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的鑒別，酵母雙雜交方法比噬菌體展示技術(shù)更有效，這是因?yàn)榻湍鸽p雜交方法直接使用誘餌蛋白的基因而不涉及對(duì)它的純化，因而它的成本會(huì)比噬菌體展示技術(shù)低一些。由于噬菌體展示技術(shù)需要純化的蛋白質(zhì)作為靶分子蛋白，因此大規(guī)模蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的鑒別可能會(huì)有很高的成本[2,5]；③“假陽(yáng)性”結(jié)果：酵母雙雜交方法的一個(gè)重要的問(wèn)題是“假陽(yáng)性”。所謂“假陽(yáng)性”，即通過(guò)雙雜交觀(guān)察到的蛋白質(zhì)之間的相互作用在真實(shí)情況下不一定發(fā)生。由于某些蛋白質(zhì)本身具有激活轉(zhuǎn)錄功能，使 DNA-BD 在無(wú)特異激活結(jié)構(gòu)域的情況下可激活轉(zhuǎn)錄；另外某些蛋白質(zhì)表面含有對(duì)多種蛋白質(zhì)的低親和力區(qū)域，能與其他蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而引起報(bào)告基因的表達(dá)，產(chǎn)生“假陽(yáng)性”結(jié)果[6]。對(duì)于噬菌體展示技術(shù)，靶蛋白在包被篩選孔板的過(guò)程中可能發(fā)生構(gòu)象松弛，這也會(huì)導(dǎo)致捕獲多肽或蛋白質(zhì)的特異性降低；④趨同進(jìn)化：利用噬菌體展示的隨機(jī)肽庫(kù)可以篩選出與靶蛋白相互作用的一些肽段，這些肽段與天然（捕獲）蛋白質(zhì)的相互作用部位很相似，這種現(xiàn)象被稱(chēng)作“趨同進(jìn)化”[7]。通過(guò)檢索全部基因組數(shù)據(jù)庫(kù)找到共有序列，再通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其是否是所要選擇的相互作用蛋白（配體）[8]。以這種方式噬菌體展示隨機(jī)肽庫(kù)獲得的信息量較酵母雙雜交方法大很多，也可用于對(duì)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用作圖；⑤體內(nèi)與體外篩選“場(chǎng)所”：酵母雙雜交方法在真核細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，有體內(nèi)翻譯后修飾，一定程度上代表細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)情況，但是對(duì)研究大量非核內(nèi)蛋白質(zhì)有局限，不適用于膜受體、細(xì)胞外分泌蛋白質(zhì)等。噬菌體展示技術(shù)是體外篩選因而更具靈活性，在一些特殊的試驗(yàn)中，比如當(dāng)靶蛋白（誘餌蛋白）和結(jié)合蛋白（捕獲蛋白）屬于不同物種時(shí)，比如對(duì)過(guò)敏原或者小分子結(jié)合蛋白質(zhì)的克隆，噬菌體展示技術(shù)對(duì)于結(jié)合蛋白的鑒別非常有效[9]；⑥時(shí)間和費(fèi)用：噬菌體展示方法需要 1 ～ 2 周左右篩選數(shù)以十億計(jì)的克隆，費(fèi)用較低；而酵母雙雜交需要 1 ～ 4 個(gè)月篩選數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的克隆，費(fèi)用較高。噬菌體展示技術(shù)與酵母雙雜交方法的比較可見(jiàn)表 1。

2 噬菌體展示系統(tǒng)表達(dá)基因組 cDNA

噬菌體展示技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于抗體庫(kù)（antibody library）技術(shù)和隨機(jī)肽庫(kù)（random peptide library）技術(shù)，然而噬菌體展示 cDNA 基因文庫(kù)的應(yīng)用比較少而且是低效的。因?yàn)?cDNA 基因文庫(kù)存在無(wú)法預(yù)測(cè)的閱讀框和終止子，很高比例的噬菌體克隆不是完整開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF）編碼的蛋白質(zhì)，故噬菌體展示技術(shù)最初沒(méi)有像酵母雙雜交方法那樣應(yīng)用到功能基因組的研究和闡明蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。但是通過(guò)發(fā)展 C-端展示和 ORF cDNA 基因文庫(kù)等一些策略，可以很好地解決以上的問(wèn)題。這些改進(jìn)的噬菌體展示技術(shù)繼承了其應(yīng)用于抗體庫(kù)展示的優(yōu)點(diǎn)，而且能高效、靈敏和準(zhǔn)確地鑒定內(nèi)源性蛋白質(zhì)[5]。

絲狀噬菌體包括 M13、f1、fd 等[9]，其基因組均為一單鏈環(huán)狀 DNA，大小約 6.4 kb，主要展示蛋白融合在衣殼蛋白 pIII 上，盡管這一系統(tǒng)在一些工作中被用于 cDNA 展示，但是它并不是最佳的選擇。這是因?yàn)閺?gIII 基因 5’ 端插入 cDNA 的 3’ 端如果包含終止密碼子，將阻止融合gIII 基因的表達(dá)。因此，在設(shè)計(jì)表達(dá)系統(tǒng)時(shí)應(yīng)該避免 cDNA融合在 gIII 基因的 5’ 端。設(shè)計(jì) Jun 和 Fos 亮氨酸拉鏈系統(tǒng)（Jun and Fos leucine zippers）就能夠避免這一問(wèn)題：Jun-pIII 蛋白在細(xì)胞質(zhì)中生成，并分泌到大腸桿菌的周質(zhì)中，與在周質(zhì)中積累的 Fos 融合蛋白聚合，F(xiàn)os 在其 C 末端與 cDNA 表達(dá)產(chǎn)物融合。位于亮氨酸拉鏈的 N 和 C 末端半胱氨酸使蛋白質(zhì)與噬菌體以二硫鍵共價(jià)連接，從而避免了噬菌體內(nèi)的蛋白質(zhì)交換。該 pIII 展示系統(tǒng)適合表達(dá)分子量在 100 kD 左右的大分子蛋白質(zhì)[10]。另一種策略是cDNA 首先與一個(gè) β 內(nèi)酰胺酶基因一起被亞克隆到一個(gè)載體上，通過(guò)氨芐西林抗性篩選來(lái)對(duì) ORF 進(jìn)行篩選[11]。第二步該 cDNA 被亞克隆到噬菌粒（phagemid）內(nèi)表達(dá)，使噬菌體表面表達(dá)富集 ORF 文庫(kù)，這一過(guò)程的效率能達(dá)到87%，而無(wú)氨芐西林抗性篩選效率只有 6%。之后進(jìn)行重組剪切掉抗性基因得到噬菌體文庫(kù)[12]。第三種策略，噬菌粒被剪斷 gIII 的輔助噬菌體活化。該方式中，噬菌粒需要提供一個(gè)完整 pIII 侵染大腸桿菌。如果噬菌粒中克隆的cDNA 不在閱讀框架內(nèi)，那么這個(gè) pIII 融合子就不會(huì)成功表達(dá)，直到發(fā)生適當(dāng)?shù)拈喿x框架移動(dòng)。另外，pVI 蛋白和pVIII 蛋白展示系統(tǒng)也適用于基因組 cDNA 的展示[13]。

表 1 噬菌體展示與酵母雙雜交的比較

展示在 T7 噬菌體表面的多肽或蛋白質(zhì)不需要通過(guò)細(xì)胞膜分泌出來(lái)，因而其表面展示多肽和蛋白的范圍廣[14-15]。M13 噬菌體是非裂解性噬菌體，它在周質(zhì)中組裝，必須經(jīng)細(xì)胞膜分泌；而 T7 是裂解性噬菌體，在細(xì)胞質(zhì)中完成組裝后直接從細(xì)胞裂解出來(lái)。另外 T7 噬菌體展示系統(tǒng)是通過(guò) C 端融合表達(dá)蛋白，插入片段被克隆到 T7 噬菌體載體基因 g10 的 C 端。因而即使插入片段內(nèi)含有終止密碼子，也同樣可以被其表達(dá)和展示，而這是在 N 端克隆的 M13無(wú)法進(jìn)行的。

λ 噬菌體是最早使用的克隆載體，其兩端為不閉合的線(xiàn)形雙鏈 DNA，末端為長(zhǎng) 12 個(gè)核苷酸的互補(bǔ)單鏈。噬菌體展示系統(tǒng)是通過(guò)將外源序列插入噬菌體頭部組裝必需的蛋白質(zhì) D 的 N 端或 C 端，或主要尾部蛋白質(zhì) V 的 C 端，實(shí)現(xiàn)外源蛋白質(zhì)的表面展示。λ 噬菌體也是裂解性噬菌體，它在宿主細(xì)胞內(nèi)完成裝配，無(wú)需將外源肽或蛋白質(zhì)分泌到細(xì)菌胞膜外，可展示有活性的大分子蛋白質(zhì)（100 kD 以上）及對(duì)宿主細(xì)胞有毒性的蛋白，適用范圍極廣，目前已被成功地用于 cDNA 基因文庫(kù)和基因組文庫(kù)[16]。該系統(tǒng)同樣適用ORF cDNA 基因文庫(kù)表達(dá)策略，在開(kāi)放閱讀框 cDNA 上增加一個(gè)含有 13 個(gè)氨基酸的生物素標(biāo)簽，這一肽段被引入到D 蛋白的 C 末端用于 λ 噬菌體展示，如果插入的 cDNA是位于 ORF，則生物素標(biāo)簽被正確表達(dá)并且被大腸桿菌BirA 酶有效生物素化，然后標(biāo)記了生物素的 ORF 噬菌體被固定的鏈霉親和素所富集。有近 79% 的噬菌體能夠展示正確的 ORF cDNA[17]。

3 利用噬菌體展示技術(shù)研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用

隨著噬菌體展示系統(tǒng)的不斷改進(jìn)，它在功能基因組學(xué)和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的研究中成為方便、靈活和有效的工具，近年來(lái)在研究疾病發(fā)生和治療如宿主-病原體、免疫原蛋白包括腫瘤抗原和過(guò)敏原、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)配體、小分子結(jié)合蛋白和酶等方面有廣泛應(yīng)用。

3.1 宿主-病原體相互作用

為了利用噬菌體展示技術(shù)來(lái)鑒定宿主-病原體的相互作用，Jacobsson 和 Frykberg[18]利用超聲波處理金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）染色體，將染色體 DNA 片段亞克隆到噬菌粒載體上。對(duì) IgG 和纖維連接蛋白（fibronectin）進(jìn)行親和篩選，能從絲狀噬菌體展示 107個(gè)克隆庫(kù)中獲得已知序列和新序列。這種方法能夠分離與哺乳動(dòng)物靶蛋白結(jié)合的細(xì)菌蛋白，并已經(jīng)應(yīng)用于從不同物種中篩選 DNA 文庫(kù)，如 Jonsson 等[19]從螺桿菌中、Jacobsson[20]從鏈球菌中和 Mullen 等[21]從巴斯德菌中分別篩選出DNA 文庫(kù)。

3.2 腫瘤抗原

使用分離腫瘤特異性抗原細(xì)胞的方法篩選抗原并不非常有效，而使用血清抗原分子篩選方法可以找到結(jié)腸癌體液免疫（colorectal cancer，CRC）的腫瘤抗原。Somers 等[22]首先構(gòu)建與絲狀噬菌體外殼蛋白 pVI 融合的 CRC 細(xì)胞系HT-2的cDNA 文庫(kù)，其中 CRC 血清來(lái)自經(jīng)歷了自身腫瘤主動(dòng)特異性免疫（active specific immunization，ASI）的患者。通過(guò)該 cDNA 基因文庫(kù)在 CRC 血清中富集，確定了19 個(gè)克隆具有反應(yīng)性，其中 17 個(gè)與腫瘤反應(yīng)。應(yīng)用該文庫(kù)篩選出 13 種抗原可以用作腫瘤疫苗或者作為預(yù)后的標(biāo)記。

3.3 過(guò)敏原

通過(guò)親和人血清 IgE 抗體可以篩選噬菌體表達(dá)的過(guò)敏原 cDNA 基因文庫(kù)。Crameri 和 Walter[23]利用絲狀噬菌體展示約含有 108個(gè)克隆煙曲霉（Aspergillus fumigatus）cDNA的表達(dá)產(chǎn)物，以過(guò)敏反應(yīng)者血清中的 IgE 抗體作靶分子親和篩選，經(jīng)過(guò)六輪篩選后，一些不同的 cDNA 表達(dá)產(chǎn)物被分離出來(lái)，其中一些過(guò)敏原能夠用于診斷過(guò)敏性支氣管肺曲霉病（allergic bronchopulmonary aspergillosis），它的癥狀在醫(yī)療上不易診斷。

3.4 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)配體

真核細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑涉及一些保守的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，例如 Src 同源家族 SH2、SH3 和 PH 家族。SH2 結(jié)構(gòu)域能夠識(shí)別含磷酸化酪氨酸的多肽，而 SH3 結(jié)構(gòu)域結(jié)合富含脯氨酸和疏水殘基的蛋白質(zhì)。為了鑒別能夠結(jié)合 SH2結(jié)構(gòu)域的胞質(zhì)酪氨酸蛋白磷酸酶（cytoplasmic tyrosine phosphatase）SHP-2，構(gòu)建了與絲狀噬菌體 gIII 基因融合的白細(xì)胞 cDNA 基因文庫(kù)（108個(gè)），它包含 200 ～ 500 bp 片段。為了降低非特異性結(jié)合蛋白質(zhì)的比例，Videlock 等[24]首先將（磷酸化之前的）cDNA 克隆與固相的 SH2 共同孵育，而噬菌體展示的 cDNA 表達(dá)產(chǎn)物在篩選之前被一個(gè)蛋白激酶磷酸化。經(jīng)過(guò)篩選發(fā)現(xiàn) SHP-2 能結(jié)合磷酸化的血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子 PECAM-1 多肽。

3.5 腦疾病蛋白

β-淀粉樣蛋白（β-amyloid peptide）在微摩爾濃度上會(huì)引起神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡。Nelson 和 Alkon[25]利用絲狀噬菌體展示技術(shù)檢測(cè)兔腦中 β-淀粉樣蛋白的蛋白質(zhì)相互作用，以鑒定出 β-淀粉樣蛋白的受體作用部位。在 8 個(gè)能識(shí)別β-淀粉樣蛋白的合成肽中，有 3 個(gè)是 β-淀粉樣蛋白引起神經(jīng)元細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用的有效阻斷劑。這些多肽能夠結(jié)合β-淀粉狀蛋白的疏水區(qū)或蛋白激酶 C 磷酸化位點(diǎn)附近，說(shuō)明了這些區(qū)域可能是 β-淀粉樣蛋白起效應(yīng)的關(guān)鍵區(qū)域。這些多肽或通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制 β-淀粉樣蛋白與它的效應(yīng)蛋白結(jié)合來(lái)防止其毒害效應(yīng)。

3.6 多酶體系

一些遺傳疾病與過(guò)氧化物酶（peroxidase）的異常有關(guān)，表明過(guò)氧化物酶體（peroxisomes）中包含了細(xì)胞代謝的重要部分。為了進(jìn)一步研究未知的過(guò)氧化物酶的代謝功能，F(xiàn)ransen 等[26]利用 M13 噬菌體展示鼠肝臟 cDNA 基因文庫(kù)，從中篩選能結(jié)合抗過(guò)氧化物酶體抗體的表達(dá)產(chǎn)物，得到了 4 個(gè) cDNA 克隆。在這4 個(gè)克隆中有 2 個(gè)是以前熟知的酶，另外 2 個(gè)是新酶，根據(jù)這 2 個(gè)新酶的 C 末端 3 個(gè)氨基酸殘基作為過(guò)氧化物酶體基質(zhì)的定位信號(hào)，通過(guò)免疫熒光觀(guān)察證明了它們是過(guò)氧化物酶體的一部分。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)50 多種代謝酶存在于哺乳動(dòng)物的過(guò)氧化物酶體中。對(duì)于過(guò)氧化物酶分子水平上基因的鑒定，使我們更好地了解了由過(guò)氧化物酶紊亂而導(dǎo)致的某一類(lèi)疾病。

3.7 小分子藥物結(jié)合蛋白

FK506（他克莫司）是一種大環(huán)內(nèi)酯聚酮類(lèi)免疫抑制劑，通過(guò)抑制相關(guān)多細(xì)胞因子的產(chǎn)生和表達(dá)來(lái)抑制 T 細(xì)胞的活化，主要用于器官和組織移植前后治療機(jī)體的排斥反應(yīng)。它可與 T 細(xì)胞胞質(zhì)的 FK-506 結(jié)合蛋白（FK binding protein）結(jié)合形成 FK506/FKBP 復(fù)合物從而影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，產(chǎn)生免疫抑制作用。為了分離能夠與免疫抑制劑 FK506 結(jié)合蛋白，Sche 等[27-28]將人腦 cDNA 文庫(kù)中的克隆在 T7 噬菌體上表達(dá)，然后與修飾后的 FK506 進(jìn)行親和篩選。FK506經(jīng)生物素化修飾包被于固相進(jìn)行篩選，McKenzie 等[29]最終篩選出了三種同源性的 FK506 結(jié)合蛋白。

4 結(jié)語(yǔ)

隨著 DNA 測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展，目前 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)已經(jīng)包括 5799 種物種的基因組數(shù)據(jù)，研究的焦點(diǎn)也正在從表達(dá)基因組轉(zhuǎn)向功能基因組，或者說(shuō)從基因組學(xué)轉(zhuǎn)向蛋白質(zhì)組學(xué)。假如說(shuō)蛋白質(zhì)可調(diào)節(jié)和控制細(xì)胞幾乎所有活動(dòng)和功能，那么找到蛋白質(zhì)之間的物理聯(lián)系也就是研究蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用是揭示基因組功能的主要研究策略。作為研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的重要工具酵母雙雜交方法和噬菌體展示技術(shù)在生物學(xué)研究系統(tǒng)中都有一定的局限性，但是由于它們的局限性不同，在很多情況下，它們可以互為補(bǔ)充[30]。比如對(duì)酵母 SH3 的蛋白質(zhì)相互作用作圖時(shí)，先用噬菌體展示肽庫(kù)進(jìn)行親和篩選，再?gòu)慕湍富蚪M數(shù)據(jù)庫(kù)中找到共同序列，最后使用酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證，噬菌體展示和酵母雙雜交的結(jié)合使“假陽(yáng)性”結(jié)果的比例大大降低[31]。對(duì)于非體內(nèi)分子的識(shí)別，例如藥物基因組學(xué)，噬菌體展示技術(shù)更加適用；ORF 噬菌體展示 cDNA 技術(shù)的進(jìn)展也提高了噬菌體展示技術(shù)在功能基因組研究的有效性、靈敏性和準(zhǔn)確性，目前噬菌體展示技術(shù)正步入發(fā)展成熟階段，并顯示出非常好的實(shí)用性，已逐漸成為疾病診斷和治療方面研究的重要手段[32-33]。

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基金項(xiàng)目：遼寧省教育廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目（2008S015）

作者單位：116034 大連工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院

通訊作者：石屹峰，Email：shiyf@dlpu.edu.cn

收稿日期：2010-02-03

DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.03.010