H3N8 型馬流感血凝素核酸疫苗的初步研究

許瑩，郭巍，王世霞，黃文強(qiáng)，張璐，盧山，周建華，相文華，黃祖瑚

H3N8 型馬流感血凝素核酸疫苗的初步研究

許瑩*，郭巍*，王世霞，黃文強(qiáng)，張璐，盧山，周建華，相文華，黃祖瑚

【摘要】

目的研發(fā)一種具有良好免疫原性的 H3N8 型馬流感血凝素（hemagglutinin，HA）核酸疫苗。

方法根據(jù)馬 A 型流感病毒 A/Equine/Xinjiang/3/08（H3N8）的 HA 蛋白序列，經(jīng)密碼子優(yōu)化后化學(xué)合成能夠表達(dá)相應(yīng)蛋白的基因片段，并將該片段克隆到核酸疫苗載體 pJW4303中，構(gòu)建帶有天然信號(hào)肽的 H3HA 核酸疫苗，命名為H3HA/XJ3-08-wt；進(jìn)一步對(duì) HA 基因進(jìn)行修飾，以人組織纖維蛋白酶原激活劑（human tissue plasminogen activator，tPA）取代 H3HA 天然信號(hào)肽，命名為 H3HA/ XJ3-08-tPA，或切除部分 HA 的基因片段使之只表達(dá) HA 蛋白的胞外域，命名為 H3HA/XJ3-08-dTM。用這 3 種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞，蛋白表達(dá)經(jīng)蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)得到確認(rèn)。采用電轉(zhuǎn)錄法免疫新西蘭白兔。ELISA 方法檢測(cè)免疫后兔血清中抗 H3HA 抗體滴度，血凝抑制實(shí)驗(yàn)（hemagglutination inhibition，HI）檢測(cè)保護(hù)性抗體水平。

結(jié)果3 種 H3HA 核酸疫苗均可在 293T 細(xì)胞中高效表達(dá)，并能夠在新西蘭白兔體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗 H3HA 抗體，HI 檢測(cè)到不同水平的保護(hù)性抗體。其中以 H3HA/XJ3-08-tPA 的免疫原性最強(qiáng)。

結(jié)論新構(gòu)建的 H3N8 型馬流感血凝素核酸疫苗具有良好的免疫原性，為此類疫苗的進(jìn)一步研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】流感病毒 A 型，H3N8 亞型； 血凝素類；疫苗，DNA

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2010, 5(3):196-201

近年來，A 型流感在不同物種中廣泛流行，如高致病性禽流感 H5N1、新型豬來源 H1N1 流感等。A 型流感同樣在馬屬動(dòng)物中頻繁爆發(fā)。國際上根據(jù)流感病毒血凝素（hemagglutinin，HA）和神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）的不同，將 HA 分成了 16 個(gè)亞型，NA 分成 9 個(gè)亞型。其中馬流感病毒包括 H7N7 和 H3N8 亞型。近 30 年來，H7N7 型馬流感病毒未再分離到，而 H3N8 型馬流感在世界范圍內(nèi)常有爆發(fā)，提示現(xiàn)有疫苗還不能有效地控制該病毒的流行[1-7]。

血凝素分子是流感病毒的主要保護(hù)性抗原。研究表明，動(dòng)物接種流感病毒血凝素 DNA 疫苗后，中和抗體效價(jià)很高，并對(duì)致死劑量流感病毒攻擊的小鼠有完全保護(hù)作用[8]。本研究根據(jù)馬 A 型流感病毒 A/Equine/Xinjiang/3/08（H3N8）[9]的 HA 氨基酸序列，設(shè)計(jì)并人工合成了能夠表達(dá)相應(yīng)蛋白質(zhì)的基因片段，構(gòu)建了三種經(jīng)密碼子優(yōu)化的核酸疫苗，并研究了其免疫原性。本實(shí)驗(yàn)為 H3N8 型馬流感疫苗的進(jìn)一步開發(fā)研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 A/Equine/Xinjiang/3/08 的 HA 基因序列信息由哈爾濱獸醫(yī)研究所馬病研究室提供；H3HA 基因序列經(jīng)密碼子優(yōu)化后人工合成，由德國Geneart 公司完成；核酸疫苗載體 pJW4303 及293T 細(xì)胞由美國馬薩諸塞州大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供；HB101 由本實(shí)驗(yàn)室保存；限制性內(nèi)切酶 BamHI、PstI、NheI 及連接酶購自美國 Promega 公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔抗血清購自聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒大量提取試劑盒購自德國 Qiagen 公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；TMB 片劑購自美國 Sigma 公司；West pico 購自美國 Pierce 公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 水平電泳儀為北京東方特力公司產(chǎn)品；凝膠圖象分析系統(tǒng)為美國 Pharmacia 公司產(chǎn)品；U-2001 型紫外可見分光光度計(jì)為日本Hitach 公司產(chǎn)品；Model 680 型酶標(biāo)比色儀、聚丙烯酰胺凝膠電泳儀均為美國 Bio-Rad 公司產(chǎn)品；WJ-2002 活體基因?qū)雰x為寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭白兔，雌性，體重 3 kg，由上海斯萊克試驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供。

1.1.4 測(cè)序公司 上海英駿生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 H3HA 核酸疫苗的構(gòu)建及鑒定 根據(jù)馬A 型流感病毒 A/Equine/Xinjiang/3/08 的基因序列，經(jīng)密碼子優(yōu)化后人工合成相應(yīng)的基因片段。雖然密碼子優(yōu)化后的 HA 基因序列不同于天然 HA基因，但其編碼的 HA 蛋白質(zhì)氨基酸序列不變。在基因片段兩端分別引入 PstI 和 BamHI 酶切位點(diǎn)，將經(jīng)此位點(diǎn)雙酶切所得的基因片段克隆到核酸疫苗載體 pJW4303 中，構(gòu)建了含天然信號(hào)肽的H3HA 核酸疫苗，命名為 H3HA/XJ3-08-wt；進(jìn)一步對(duì) HA 基因進(jìn)行修飾，以人組織纖維蛋白酶原激活劑（human tissue plasminogen activator，tPA）取代 H3-XJ 天然信號(hào)肽或切除部分 HA 基因片段使之只表達(dá) HA 蛋白的胞外域，并在其兩端分別引入 NheI 和 BamHI 酶切位點(diǎn)，將經(jīng)此雙酶切所得的基因片段克隆到核酸疫苗載體 pJW4303中，得到另外兩種表達(dá) H3HA 蛋白的核酸疫苗，分別命名為 H3HA/XJ3-08-tPA 和 H3HA/XJ3-08-dTM（圖 1）。構(gòu)建的上述核酸疫苗均經(jīng)過限制性內(nèi)切酶酶切和測(cè)序鑒定。核酸疫苗以及空載體質(zhì)粒 pJW4303 分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌 HB101，經(jīng)大量擴(kuò)增后，提取制備高純度質(zhì)粒，用生理鹽水稀釋成1 μg/μl，–20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

圖 1 H3HA 核酸疫苗的設(shè)計(jì)Figure 1 The design of H3HA DNA vaccines

1.2.2 馬流感 H3HA 核酸疫苗的體外表達(dá)及檢測(cè) 將以上構(gòu)建好的核酸疫苗以及空載體pJW4303 分別用 PEI（polyethylenimine）法轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后 72 h 收集培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解液。用 Western blot 法檢測(cè)馬流感 HA 抗原，觀察核酸疫苗在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)以及向細(xì)胞外分泌的情況。具體步驟如下：灌制 10% SDS-PAGE 電泳膠；取培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解液各 20 μl，分別加入 5 μl 的上樣 Buffer，煮沸 5 min 后上樣，電泳；轉(zhuǎn)膜，100 V，1 h；封閉，5% 脫脂奶粉，4 ℃ 過夜；1% 脫脂奶粉 1∶500 稀釋 H3HA/XJ3-08-tPA核酸疫苗的兔免疫血清，室溫?fù)u床上慢搖孵育 1 h；PBST 漂洗濾膜 6 次，每次 10 min；1% 脫脂奶粉 1:5000 稀釋 HRP 標(biāo)記的羊抗兔 IgG 抗血清，室溫?fù)u床上慢搖孵育 1 h；PBST 漂洗濾膜 6 次，每次 10 min；顯影以及定影后觀察結(jié)果。

1.2.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 通過活體基因?qū)雰x進(jìn)行DNA 免疫。12 只 3 kg 新西蘭白兔隨機(jī)平均分成4 組，分別接受空載體質(zhì)粒 pJW4303、核酸疫苗H3HA/XJ3-08-wt、H3HA/XJ3-08-tPA 或 H3HA/XJ3-08-dTM 免疫，程序?yàn)?0、2、4、8 周各一次，每次每兔四點(diǎn)注射共 200 μg 質(zhì)粒 DNA（圖 2）。注射后立即于注射部位用 WJ-2002 活體基因?qū)雰x進(jìn)行體內(nèi)電轉(zhuǎn)染（技術(shù)參數(shù)：電壓 100 V，脈沖次數(shù)正反各 6 次，波寬 60 ms，頻率 60 Hz），兔腿部肌肉發(fā)生抖動(dòng)視為電轉(zhuǎn)錄有效。首次免疫前以及每次免疫后 2 周耳中動(dòng)脈采血 10 ml，分離血清，–70 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

圖 2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組及 H3HA 核酸疫苗免疫程序Figure 2 Rabbits grouping and Immunization schedule for H3HA DNA vaccines

1.2.4 馬流感 H3HA 核酸疫苗抗體應(yīng)答的檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）間接法檢測(cè)抗馬流感 H3HA 抗體[10]。具體步驟如下：包被抗原：H3HA/XJ3-08-dTM 轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞收獲的上清，用 1 × PBS 按照 1∶5 稀釋作為抗原包被ELISA 板，100 μl/孔，4 ℃ 過夜；PBST 洗 3 次，5% 脫脂奶粉封閉，200 μl /孔，37 ℃，2 h；PBST洗 3 次，加入 1% 脫脂奶粉 1∶500 稀釋的待檢血清，100 μl/孔，37 ℃，1 h；PBST 洗 5 次，加入 1%脫脂奶粉 1∶2 000 稀釋的生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG；100 μl/孔；37 ℃，1 h；PBST 洗 5 次，加入1% 脫脂奶粉 1∶5 000 稀釋的 HRP 標(biāo)記的鏈親和素，100 μl/孔；37 ℃，1 h；PBST 洗 5 次，TMB顯色，100 μl/孔，3.5 min。最后用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值。

1.2.5 血凝抑制試驗(yàn)（HI） 血清處理方法：采用胰蛋白酶-高碘酸鹽處理方法，具體如下：加入1/2 體積的胰蛋白酶溶液于 1 體積的血清中，56 ℃滅活 30 min 后取出并冷卻至室溫。加 3 體積的0.11 mol/L 過碘酸鉀，混勻，室溫孵育 15 min，其后加 3 體積的 1% 甘油溶液，室溫孵育 15 min。最后加 2.5 倍體積的 0.85% 生理鹽水并混勻。該處理后血清的終稀釋度為 1∶10。胰蛋白酶溶液：將 200 mg 的胰酶溶于 25 ml 0.1 mol/L pH 8.2 的1 × PBS 中，過濾除菌后小量分裝，–20 ℃ 保存。

采用血凝抑制實(shí)驗(yàn)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中 HI 抗體水平。具體步驟如下：標(biāo)記 96 孔微量板，每孔加25 μl 1 × PBS；第一行每孔加 25 μl 待測(cè)血清，混勻（1∶2），最后一孔不加作為對(duì)照；吸取第一孔中血清 25 μl 到下一孔，混勻，依次進(jìn)行倍比稀釋（1∶4），以此類推到其他孔，棄掉最后一孔中吸取的 25 μl 液體；每孔加上 25 μl 的 4 單位標(biāo)準(zhǔn)化抗原，22 ℃ 孵育 30 min；每孔加入 50 μl 標(biāo)準(zhǔn)化紅細(xì)胞，如前混勻，22 ℃ 孵育 30 min；判定并記錄結(jié)果。陰性對(duì)照為免疫前的混合血清。

2 結(jié)果

2.1 馬流感 H3HA 核酸疫苗的構(gòu)建及表達(dá)

將構(gòu)建好的質(zhì)粒測(cè)序，結(jié)果顯示其核酸序列與本研究原先設(shè)計(jì)的核酸序列完全一致。將 H3HA-wt、H3HA-tPA、H3HA-dTM 轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞 72 h后，獲取細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解液，以 H3HA-tPA的免疫兔血清行 Western blot 檢測(cè)。結(jié)果顯示，所設(shè)計(jì)的密碼子優(yōu)化后的血凝素基因均有目的蛋白的表達(dá)（約 72 kD）。其中 H3HA-dTM 在上清中也能檢測(cè)到蛋白的表達(dá)（約 90 kD），而空載體pJW4303 轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞培養(yǎng)上清及裂解液中均檢測(cè)不到 H3HA 蛋白的表達(dá)，如圖 3 所示。提示H3HA-wt、H3HA-tPA、H3HA-dTM 轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞后均可在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，H3HA-dTM 還可以將表達(dá)產(chǎn)物分泌到細(xì)胞外。

2.2 馬流感 H3HA 核酸疫苗的抗體應(yīng)答

用構(gòu)建好的馬流感 H3HA 核酸疫苗免疫新西蘭白兔。結(jié)果表明：第 2 次免疫后 2 周，三組核酸疫苗免疫的動(dòng)物血清中均可檢測(cè)到特異性抗 H3HA 抗體；第 3 次免疫后 2 周，特異性抗H3HA 抗體水平明顯升高。隨著免疫次數(shù)的增加，H3-tPA 免疫血清特異性抗體水平上升的速度最快，顯著高于 H3HA-wt 和 H3HA-dTM 免疫組（P ＜ 0.01）。而 H3HA-wt 和 H3HA-dTM 兩組免疫血清，特異性抗體水平上升情況無明顯差異。陰性對(duì)照組無抗體反應(yīng)（圖 4）。第 4 次免疫后 2 周，三組免疫動(dòng)物血清中特異性抗 H3HA 抗體的平均滴度分別為：H3HA-tPA 組：1∶56 300；H3HA-wt組：1∶13 500；H3HA-dTM 組：1∶6 500（圖 5）。

圖 3 三種核酸疫苗在 293T 細(xì)胞中的表達(dá)Figure 3 Transient expression of DNA vaccines in 293T cell line

圖 4 各組新西蘭白兔免疫血清抗 H3HA 抗體水平的動(dòng)態(tài)變化Figure 4 Temporal changes of serum anti-H3HA IgG in different rabbit groups

2.3 免疫動(dòng)物血清 HI 抗體的檢測(cè)

血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果顯示：第 4 次免疫后 2 周，各組新西蘭白兔均產(chǎn)生了 HI 抗體，其中 H3HA-tPA 組血凝抑制效價(jià)最高，達(dá)到 1∶320；H3HA-wt組次之，平均血凝抑制效價(jià)為 1∶90；H3HA-dTM組血凝抑制效價(jià)最低，只有 1∶16。免疫前血清血凝抑制效價(jià)小于 1∶8（圖 6）。

圖 5 各組新西蘭白兔免疫血清抗 H3HA 抗體的終點(diǎn)滴度Figure 5 Serum end–point anti-H3HA IgG titers in different rabbit groups

圖 6 各組新西蘭白兔免疫前后血清 HI 水平Figure 6 Serum HI titers in different rabbit groups

3 討論

在很多物種中都已經(jīng)證明，運(yùn)用 DNA 疫苗免疫可以誘導(dǎo)較強(qiáng)的特異性免疫保護(hù)反應(yīng)。DNA 疫苗因其能夠同時(shí)激起機(jī)體的體液以及細(xì)胞免疫而優(yōu)于傳統(tǒng)的滅活疫苗，加上其生產(chǎn)成本低廉、可規(guī)模生產(chǎn)、易于保存而具有廣泛的市場(chǎng)前景[11-12]。到目前為止，已經(jīng)有 4 種運(yùn)用于動(dòng)物的 DNA 疫苗取得上市許可，分別為運(yùn)用于馬的西尼羅病毒DNA 疫苗、運(yùn)用于鮭魚的傳染性造血組織壞死病DNA 疫苗、運(yùn)用于狗的黑色素瘤 DNA 疫苗和降低幼豬致病率及致死率的生長(zhǎng)激素釋放激素 DNA疫苗[13-14]。

我國的馬流感疫苗研究工作相對(duì)遲滯。20 世紀(jì) 70 年代研制成馬流感滅活疫苗，目前國內(nèi)未見有新疫苗的開發(fā)研究。國際上對(duì)于 H3N8 馬流感疫苗已經(jīng)進(jìn)行較為深入的研究，也包括 DNA 疫苗。Soboll 等以馬流感病毒 A/equine/Kentuchy/1/81的血凝素基因片段為依據(jù)，構(gòu)建了馬流感 HA 核酸疫苗，以基因槍免疫馬，共免疫 3 次，多位點(diǎn)注射，間隔 60 d 一次。免疫結(jié)束后的同型流感病毒攻毒試驗(yàn)表明，疫苗的保護(hù)效果較好[15-16]。證明了HA 核酸疫苗在抗馬 H3N8 流感方面的成功運(yùn)用。在此基礎(chǔ)上，我們對(duì) H3HA 基因序列進(jìn)行了優(yōu)化和修改，設(shè)計(jì)了 3 種表達(dá) H3HA 抗原的核酸疫苗。其中以 tPA 組的效果最理想。說明在插入完整H3HA 基因的情況下，以 tPA 信號(hào)肽取代原始信號(hào)肽后，核酸疫苗在體外的表達(dá)增強(qiáng)，免疫原性增強(qiáng)。一般認(rèn)為血凝抑制效價(jià)大于 64 即可產(chǎn)生臨床保護(hù)[17]。據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)，tPA 組及 wt 組免疫后產(chǎn)生了具有保護(hù)作用的中和抗體，而 dTM 組盡管產(chǎn)生了一定的結(jié)合抗體，但未產(chǎn)生中和抗體。在既往H1HA 流感 DNA 疫苗的研究過程中也曾發(fā)現(xiàn)：完整的 H1HA 產(chǎn)生中和抗體的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于去掉跨膜區(qū)的 H1HA[18]?？赡苁侨サ艨缒^(qū)及胞內(nèi)區(qū)基因的馬 H3HA 核酸疫苗在表達(dá)成 HA 抗原的過程中分子構(gòu)象發(fā)生改變，或關(guān)鍵抗原表位隱藏、消失或改變，免疫原性降低，不能產(chǎn)生中和抗體。

流感疫苗最大的問題是流感血凝素通過抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)換發(fā)生頻繁的變異，這對(duì)于研發(fā)廣泛適用性的 HA 疫苗增加了難度。香港 1992 年爆發(fā)馬流感過程中，有 75% 的免疫馬不能抵抗感染，英國和意大利等也有過類似報(bào)道[2-4]?？梢娪捎诓《镜淖儺?，原有疫苗往往不能提供良好的保護(hù)力；對(duì)于不同譜系的毒株，單價(jià)疫苗只能提供有限的保護(hù)[19]。解決的方法包括：①根據(jù)流行的毒株不斷更新現(xiàn)有疫苗；②制成多價(jià)疫苗等。Kodihalli 等[20]發(fā)現(xiàn)，在 HA1 亞型氨基酸序列同源性有 11% ～13% 差異的變異株致死劑量攻擊時(shí)，HA DNA 疫苗仍然具有交叉保護(hù)性作用。故如采用不同來源的HA 基因制成二價(jià)或多價(jià)疫苗，可能其免疫后產(chǎn)生的交叉保護(hù)性更強(qiáng)，所針對(duì)的流感毒株范圍更廣，效果更好。在后續(xù)工作中，我們將著重研究不同毒株 HA 基因制成的多價(jià) DNA 疫苗，期望研制開發(fā)出具有較強(qiáng)免疫原性、能夠?qū)Χ喾N毒株感染產(chǎn)生確切保護(hù)的抗 H3N8 型馬流感核酸疫苗。

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ObjectiveTo develop a higly immunogenic DNA vaccine against equine influenza H3N8.

MethodsAccording to the amino acids sequence of HA antigen from equine influenza A strain A/Equine/Xinjiang/3/08 (H3N8), a codon optimized H3HA genes was chemically synthesized. It was then subcloned into vector pJW4303 to express the wild type HA insert (H3HA /XJ3-08-wt). The codon optimized HA gene was further modified to either replace the original HA leader sequence with a human tissue plasminogen activator (tPA) leader (H3HA /XJ3-08-tPA) or truncate the HA coding sequence to express only the extracellular portion of the HA protein (H3HA/XJ3-08-dTM). The expression of the above three HA DNA vaccines was verified in 293T cells by Western blot analysis. New Zealand White rabbits were vaccinated with three versions of HA DNA vaccines or vector individually by electroporation. H3HA specific antibody responses in rabbit sera were analyzed by ELISA and the protective antibody activities were measured by HI against equine H3N8 virus.

ResultsThe H3HA DNA plasmids could express HA antigen successfully in 293T cells in vitro, and induced high level protective anti-H3HA antibody. Among three H3HA DNA vaccines, HA DNA vaccine design with a tPA leader showed the best immunogenicity.

ConclusionOptimal HA DNA vaccines against H3N8 equine influenza have been successfully constructed, affording a new way to develop equine H3N8 vaccine in the future.

【Key words】Influenza A virus, H3N8 subtype; Hemagglutinins; Vaccines, DNA

Author Affiliations: Department of Infectious Diseases, and China-US Vaccine Research Center, The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China (XU Ying, WANG Shi-xia, ZHANG Lu, LU Shan, HUANG Zu-hu); Division of Livestock Infectious Diseases, State Key Laboratory Veterinary Biotechnology, Harbin Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150001, China (GUO Wei, HUANG Wen-qiang, ZHOU Jian-hua, XIANG Wen-hua); Department of Internal Medicine, Umiversity of Massachusetts Medical School, Worcester 01605, America (WANG Shi-xia, LU Shan)

*第一、二作者同等貢獻(xiàn)

Corresponding authors:XIANG Wen-hua, Email: xiangwenhua1@yahoo.com.cn; HUANG Zu-hu, Email: huangzh@jswst.gov.cn www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2010, 5(3):196-201

基金項(xiàng)目：黑龍江省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（ZD200812）；獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（NKLVBP200815）；江蘇省自然科學(xué)基金（BK2006728）

作者單位：210029 南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染病科/江蘇省人民醫(yī)院中美疫苗中心（許瑩、王世霞、張璐、盧山、黃祖瑚）；150001 哈爾濱，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室大動(dòng)物病研究室（郭巍、黃文強(qiáng)、周建華、相文華）；01605 渥斯特，美國麻省大學(xué)醫(yī)學(xué)院內(nèi)科學(xué)系（王世霞、盧山）

通訊作者：相文華，xiangwenhua1@yahoo.com.cn；黃祖瑚，Email：huangzh@jswst.gov.cn

收稿日期：2010-01-18

DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.03.007

The optimization of HA DNA vaccines against equine H3N8 influenza

XU Ying, GUO Wei, WANG Shi-xia, HUANG Wen-qiang, ZHANG Lu, LU Shan, ZHOU Jian-hua, XIANG Wen-hua, HUANG Zu-hu

【Abstract】