乳腺癌特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)小肽融合表達載體的構(gòu)建以及目的蛋白的表達

高嫦娥，洪敏，劉為青，何敏潔，繆延棟，王苗，呂加令，董堅

乳腺癌特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)小肽融合表達載體的構(gòu)建以及目的蛋白的表達

高嫦娥，洪敏，劉為青，何敏潔，繆延棟，王苗，呂加令，董堅

【摘要】

目的構(gòu)建乳腺癌特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)小肽 PI-增強型綠色熒光蛋白融合蛋白的原核表達載體，并進行目的蛋白的表達、分離和純化。

方法合成 PI 的 DNA 序列，將其定向插入到 p EGFPN2中，經(jīng)雙酶切獲取 PI-EGFP 的核苷酸序列，再將其克隆入原核表達質(zhì)粒 pET-28a(+)，構(gòu)建出 pET-28a(+)-PI-EGFP 的原核表達載體；重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 BL21(DE3)pLysS 感受態(tài)細胞，經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)表達，利用 His-tag 對蛋白進行分離純化，SDS-PAGE 電泳和蛋白質(zhì)印跡免疫分析（Western blot）鑒定純化蛋白質(zhì)。

結(jié)果成功構(gòu)建了 pET-28a(+)-PI-EGFP 的原核表達載體；其經(jīng)誘導(dǎo)后，在大腸桿菌中高效表達，目的蛋白以可溶性形式存在；SDS-PAGE 分析顯示，在相對分子量約 33 kD 的位置出現(xiàn)目的蛋白條帶，與理論值相符；經(jīng) His TALONTMCartridge 親和層析純化獲得了高純度的重組的 PI-EGFP融合蛋白，Western blot 鑒定結(jié)果顯示獲得了目的蛋白。

結(jié)論成功構(gòu)建出乳腺癌特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)小肽 PI-增強型綠色熒光蛋白融合蛋白原核表達載體，并能夠表達出 PI-EGFP的融合蛋白，為進一步研究小肽的乳腺癌特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)功能奠定基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】乳腺腫瘤； 重組融合蛋白質(zhì)類； 綠色熒光蛋白類

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2010, 5(3):177-180

PI，乳腺癌特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)小肽，是利用表達 108多肽序列的 pC89 噬菌體肽庫與人乳腺癌細胞MDA-MB-231 共培養(yǎng)篩選出的一條腫瘤細胞特異性十一肽 CASPSGALRSC[1-3]。其具有乳腺癌細胞MDA-MB-231 的特異性，而與其他乳腺癌細胞株，以及其他組織來源實體瘤細胞株，尤其是人體正常細胞株無親和性，不能穿過這些細胞的胞膜進入細胞內(nèi)。GFP 的突變體——增強型綠色熒光蛋白（EGFP）（64 位苯丙氨酸→亮氨酸），作為一種報告基因來研究基因表達、調(diào)控、細胞分化及蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)定位和轉(zhuǎn)運等[4]。

本研究擬制備乳腺癌特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)小肽與增強型綠色熒光蛋白的融合蛋白，利用增強型綠色熒光蛋白的發(fā)光特性，使觀察小肽在體內(nèi)的分布情況成為可能，以便進一步研究小肽的特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，為后續(xù)小肽的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)機制的研究做好鋪墊。

1 材料與方法

1.1 材料

T4 DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶、DNA 標準分子量 λ-EcoT14 I digest DNA 標記物購自大連寶生物公司；小片段凝膠回收試劑盒購自德國 Qiagen公司；His TALONTMCartridge Purification Kit 及Universal His Western Blot Kit 2.0 kit 購自美國Clontech 公司；原核表達質(zhì)粒 pET-28a(+) 購自德國 Novagen 公司；大腸桿菌菌株 E. coli DH5α 由本實驗室保存；表達菌株 BL21(DE3)pLysS 購自美國 Promega 公司。

1.2 方法

1.2.1 PI-EGFP融合片段的獲得 由大連寶生物公司合成并測序鑒定的真核表達載體 p EGFPN2-PI，經(jīng) NotI，HindIII雙酶切 2 h 后，加入 10 × Loading Buffer 終止反應(yīng)，1% 的瓊脂糖凝膠電泳，利用試劑盒對其進行膠回收，用 10 μl 的滅菌的雙蒸水溶解，得到純化的濃度較高的目的片段 PI-EGFP。

1.2.2 線性載體 pET-28a(+) 的獲得 原核表達載體 pET-28a(+) 經(jīng)上述同樣的雙酶切后，按同樣方法進行膠回收，用 5 μl 的滅菌雙蒸水溶解，得到純化的濃度較高的線性載體片段。

1.2.3 融合表達載體的構(gòu)建 將獲得的目的片段與線性載體在 T4 DNA 連接酶作用下，16 ℃ 連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 E.coli DH5α 感受態(tài)細胞，篩選 Kan 陽性重組子，提取質(zhì)粒后用 NotI，HindIII進行雙酶切。收集新鮮菌液以及提取的質(zhì)粒 DNA送大連寶生物工程有限公司測序。

1.2.4 融合蛋白的表達及表達產(chǎn)物的可溶性分析 將原核表達質(zhì)粒 pET-28a(+) 及重組子 pET-28a(+)-PI-EGFP 分別轉(zhuǎn)化入表達菌株 BL21(DE3) pLysS 感受態(tài)細胞（卡那陽性板），挑菌，搖菌，取過夜菌液以 1∶100 的比例接種于含 50 μg/ml卡那霉素的 LB 液體培養(yǎng)基中，搖菌至 OD 值為0.4 ～ 0.6，分別取 1 ml 作為未誘導(dǎo)對照，余加入終濃度為 1.0 mmol/L 的 IPTG 誘導(dǎo)，誘導(dǎo) 2 h，收集 1.5 ml 培養(yǎng)液中的誘導(dǎo)菌進行 SDS-PAGE 表達分析，同時收集 10 ml 菌液菌體，–70 ℃ 凍存。取出上述菌體，收集細胞并重懸于 50 mmol/L Tris-HCl，2 mmol/L EDTA，pH 8.0 緩沖液。簡單凍融，或者加入 0.1% Triton-X 100，裂解細胞。破菌后離心收集上清（細菌核質(zhì)蛋白）和沉淀（包涵體），分別加入 4 × SDS 上樣緩沖液。取適量樣品進行 SDS-PSGE 凝膠電泳分析。

1.2.5 融合蛋白的分離純化 收集誘導(dǎo)菌株細胞沉淀，進行純化樣品的準備，每 100 mg 中加入2 ml His TALON Tractor Buffer，懸浮細菌沉淀，每2 ml His TALON Tractor Buffer 中加入 DNA ase I 1 μl，輕輕混勻，冰上放置 15 min，4 ℃，10 000 × g，離心 20 min，收集上清，即為細菌裂解液。利用 His TALONTMCartridge Purification Kit 進行融合蛋白的純化。過柱前用 0.45 μm 孔徑的濾器過濾上清收集液。經(jīng)過柱，洗柱，溶解，洗脫，收集純化的目的蛋白，–70 ℃ 保存。細胞裂解液、純化蛋白各取 10 μl，12% SDS-PAGE 凝膠電泳分析。

1.2.6 融合蛋白的鑒定及定量分析 將純化的目的蛋白利用核酸蛋白分析儀進行蛋白定量分析后，進行 SDS-PAGE 電泳，電泳后分別進行考馬斯亮藍染色和免疫印跡分析，轉(zhuǎn)膜后，按照 Universal His Western Blot Kit 2.0 進行免疫反應(yīng)。利用Universal His antibody 對其進行免疫反應(yīng)，Streptavidin-HRP 發(fā)光，充分洗滌后，加入底物顯色液顯色后攝影保存。

2 結(jié)果

2.1 目的片段 PI-EGFP 以及線性載體 pET-28a(+)的獲得

p EGFPN2-PI，pET-28a(+) 分別經(jīng)雙酶切后，1% 的瓊脂糖凝膠電泳，分別在 770 和 5360 bp有清晰的條帶，與預(yù)期值相符。電泳結(jié)果如圖 1。

圖 1 真核表達質(zhì)粒 p EGFPN2-PI，原核表達質(zhì)粒 pET-28a(+) 的酶切Figure 1 Eukaryotic expression vector p EGFPN2-PI and prokaryotic expression vector pET-28a(+) digested by enzyme

2.2 重組原核表達載體 pET-28a(+)-PI-EGFP 的酶切及測序鑒定

經(jīng) NotI，HindIII 雙酶切質(zhì)粒 p EGFPN2-PI及載體 pET-28a(+) 連接產(chǎn)生的重組質(zhì)粒 pET-28a(+)-PI-EGFP，重組質(zhì)粒被線性化。分別得到 770和 5360 bp 兩條帶，如圖 2 所示。并經(jīng)寶生物有限公司測序，結(jié)果與理論預(yù)測結(jié)果一致。

圖 2 重組子 pET-28a(+)-PI-EGFP 的酶切鑒定Figure 2 Recombinant vector pET-28a(+)-PI-EGFP digested by enzyme

2.3 融合蛋白的表達及可溶性分析

陽性重組質(zhì)粒經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)表達，表達產(chǎn)物用 12% SDS-PAGE 檢測，凝膠電泳圖利用BandScan 軟件分析顯示：IPTG 誘導(dǎo)表達最佳濃度為 1.0 mmol/L，最佳誘導(dǎo)時間為2 h，最佳誘導(dǎo)溫度為 37 ℃。IPTG 誘導(dǎo)后的菌體，離心收集上清與沉淀，分別 SDS-PAGE 凝膠電泳（圖 3）。從圖中可以看出：第 7 泳道可見陽性重組子在相對分子質(zhì)量約 33 kD 處有一條蛋白帶，此蛋白與理論預(yù)期的融合蛋白相對分子質(zhì)量大小相符。并將得到的細菌沉淀破菌后 SDS-PAGE 凝膠電泳顯示上清中蛋白含量較高，即表達產(chǎn)物主要分布在細菌核質(zhì)中，以可溶性形式表達。

2.4 融合蛋白的分離純化及鑒定

經(jīng) His TALONTMCartridge Purification Kit 分離純化后，表達產(chǎn)物經(jīng)核酸蛋白分析儀檢測，其濃度約為 400 μg/ml。經(jīng) 12% SDS-PAGE 凝膠電泳，考馬斯亮藍染色，在 2 泳道可見單一的目的條帶（圖 4），凝膠經(jīng)過電轉(zhuǎn)膜，膜封閉后，結(jié)合His-Dectction Reagent，Streptavidin-HRP 顯色后，在第 2 泳道可見相對分子質(zhì)量約為 33 kD 的蛋白印跡條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖 4）。

圖 3 重組蛋白 PI-EGFP 表達的 SDS-PAGE 分析Figure 3 SDS-PAGE analyze expression product

圖 4 純化后蛋白的鑒定和定量分析（A：考馬斯亮藍染色分析；B：免疫印記分析）Figure 4 Analysis of purified protein. A: dyed by Coomassie brilliant blue; B: Western blot analysis.

3 討論

蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)（PTD）[5-6]是近十幾年來生命科學(xué)領(lǐng)域發(fā)現(xiàn)的一種特殊現(xiàn)象。具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的蛋白是通過其結(jié)構(gòu)中的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域?qū)崿F(xiàn)在細胞間的轉(zhuǎn)導(dǎo)。這些蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)多肽一般是不超過 30 個氨基酸的堿性短肽[7-8]。目前已有一些學(xué)者利用 Tat、VP22或短肽將 DNA 導(dǎo)入細胞內(nèi)或體內(nèi)，從而誘導(dǎo)了細胞的凋亡，對腫瘤細胞起到一定的殺傷效應(yīng)[9-10]。PTD 因具有能攜帶基因表達產(chǎn)物-蛋白質(zhì)自由進入細胞的獨特功能，從而為人類一些疾病的基因治療提供了一種新的運載工具。

本課題已獲得的乳腺癌細胞靶向多肽CGSLSRAPSAC 有別以往研究中的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)序列，多肽轉(zhuǎn)導(dǎo)具有乳腺癌細胞靶向性，多肽在靶細胞間的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高，達 90% 以上，顯示出針對腫瘤細胞的高效靶向性優(yōu)勢，有望成為基因治療乳腺癌的載體工具，提高乳腺癌治療的靶向性。

前期實驗研究表明[11]，乳腺癌特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)小肽PI 能夠攜帶分子量大約為 26 kD 的 GST 蛋白進入乳腺癌 MDA-MB-231 細胞內(nèi)，從而證實了 PI具有攜帶功能。但不足之處在于，對于其在體內(nèi)的特異性分布情況以及其轉(zhuǎn)導(dǎo)機制不能作出解釋。

本研究通過乳腺癌特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)性小肽 PI，與真核表達質(zhì)粒 p EGFPN2成功構(gòu)建出 PI 與增強型綠色熒光蛋白的融合表達載體。用增強型綠色熒光蛋白的發(fā)光特性對其進行標記，經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)使其在表達菌株中成功表達 PI-EGFP 的融合蛋白，利用試劑盒分離純化得到高純度的目的融合蛋白。經(jīng)SDS-PAGE 及 Western blot 鑒定，成功獲得了分子量大小為 33 kD 的目的融合蛋白。

在以后的研究中，我們將利用 GFP 作為融合標簽這一特性，通過 PI 攜帶熒光強度比 GFP 強6 倍的突變體增強型綠色熒光蛋白（EGFP），以便觀察 PI 在體內(nèi)的靶向性轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，即特異性地將GFP 轉(zhuǎn)導(dǎo)到荷乳腺癌裸鼠的腫瘤部位，同時觀察其在體內(nèi)其他器官的含量，得出不同器官的分布情況，為其在體內(nèi)的代謝作出初步的了解。以此為依據(jù)，找出與乳腺癌細胞特異的可能的結(jié)合位點，為我們對其轉(zhuǎn)導(dǎo)機制的深入研究奠定了良好的基礎(chǔ)，并指導(dǎo)我們開發(fā)其他腫瘤細胞的特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)多肽，提高多種腫瘤治療的靶向性。

參考文獻

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ObjectiveTo construct a prokaryotic vector for breast cancer specific transductive peptide(PI) and enhanced green fluorescent protein(EGFP), aiming to produce fusion protein PI-EGFP ,which was induced and expressed in E.coli.

MethodsFirst construct an eukaryotic expression vector p EGFPN2-PI, to obtain fusion fragment PI-EGFP, then insert it into the prokaryotic vector pET-28a(+) to get pET-28a(+)-PI-EGFP，which was transformed into E.coli BL21(DE3)pLysS. Expression of E.coli BL21(DE3)pLysS was induced by IPTG. Purify the protein with His TALONTMCartridge Purification Kit. The specific protein expression product was detected by SDS-PAGE and western blot.

ResultsAfter sequencing identification, pET-28a(+)-PI-EGFP was constructed successfully. The fusion protein was expressed effectively in E.coli BL21(DE3)pLysS after transformed by the vector and induced by IPTG. Besides, it is soluble. The specific fusion protein had an apparent related molecular weight of about 33 kD as indicated by SDS-PAGE analysis, which in line with the theoretical value. Hight purity specific fusion protein was purified by His TALONTMCartridge affinity chromatograph and was identified by SDS-PAGE and western blot.

ConclusionThe PI prokaryotic vector with pET-28a(+)-PI-EGFP can effectively express PI-EGFP fusion protein ,laying a foundation for further study of the transduction function about PI.

【Key words】Breast neoplasms; Recombinant fusion proteins; Green fluorescent proteins

Author Affiliation: Center of Biotherapy, The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650031, China

Chin Med Biotechnol, 2010, 5(3):177-180

Corresponding Author:DONG Jian, Email: dongjian18@yahoo.com.cn www.cmbp.net.cn

基金項目：國家自然科學(xué)基金（30860330）

作者單位：650031 昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院生物治療中心

通訊作者：董堅，Email：dongjian18@yahoo.com

收稿日期：2010-02-22

DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.03.003

Construction of a prokaryotic expression vector for breast cancer transductive peptide and expression in E.coli BL21(DE3)pLysS

GAO Chang-e, HONG Min, LIU Wei-qing, HE Min-jie, MIAO Yan-dong, WANG Miao, Lü Jia-ling, DONG Jian

【Abstract】