兩種納米金標記 p53 抗體探針的制備、表征和性質(zhì)研究

黃云艷，賈春平，劉美英，金慶輝，趙建龍，趙林川

兩種納米金標記 p53 抗體探針的制備、表征和性質(zhì)研究

黃云艷，賈春平，劉美英，金慶輝，趙建龍，趙林川

【摘要】

目的制備 IgG-Au-HRP 和 IgG-Au-DNA-HRP 兩種納米金標記 p53 抗體探針，并對其進行生物學(xué)特征表征和性質(zhì)研究。

方法利用納米金粒子與蛋白質(zhì)非共價吸附和與巰基修飾的寡核苷酸以 Au-S 鍵共價結(jié)合的特點，將辣根過氧化物酶（HRP）直接或通過寡核苷酸鏈間接標記在納米金表面，制備兩種多功能納米金生物探針（IgG-Au-HRP 和IgG-Au-DNA-HRP 探針）；應(yīng)用透射電鏡、紫外-可見光光譜等對納米金探針性能進行表征，對納米金探針表面 HRP酶活性進行分析，并通過酶免疫標記技術(shù)（enzyme linked immuncsorbent assay，ELISA）優(yōu)化探針制備條件和比較兩種探針標記效率。

結(jié)果①兩種新型探針具有良好的單分散性，大小均一，粒徑約 10 nm；②p53 蛋白檢測效果對 IgG-Au-HRP 和IgG-Au-DNA-HRP 探針制備條件優(yōu)化結(jié)果表明：制備IgG-Au-HRP 探針時，HRP 分子和 p53 抗體的最佳比例為10∶1；制備 IgG-Au-DNA-HRP 探針時，DNA 和 p53 抗體的最佳比例為 2.5∶1；③HRP 分子定量檢測顯示：一個IgG-Au-HRP 探針可標記 HRP 數(shù)量約 11 個，IgG-Au-DNA-HRP 探針可標記 HRP 數(shù)量為 20 個；④兩種探針結(jié)合 ELISA 法初步檢測 p53 蛋白判定 IgG-Au-DNA-HRP探針比 IgG-Au-HRP 探針檢測蛋白靈敏度高。

結(jié)論兩種新型納米金探針制備簡單，可作為一種新型探針應(yīng)用于微量蛋白的高靈敏檢測。

【關(guān)鍵詞】酶聯(lián)免疫吸附測定； 腫瘤抑制蛋白質(zhì) p53；辣根過氧化物酶； 金屬納米粒子； 生物傳感技術(shù)

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2010, 5(3):171-176

p53 蛋白是由與人類腫瘤發(fā)生相關(guān)性最高的p53 抑癌基因突變產(chǎn)生[1]。p53 基因的突變引起p53 蛋白空間構(gòu)象的改變，以及其他因素導(dǎo)致 p53蛋白不易水解，半衰期較長，使之失去了抑制細胞生長的功能，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[2]。p53蛋白過度表達預(yù)示腫瘤患者腫瘤的侵襲力強、易發(fā)生轉(zhuǎn)移、預(yù)后性差，因此，p53 蛋白是個非常有價值的腫瘤預(yù)后因子。

傳統(tǒng)的 p53 蛋白檢測方法有放射免疫分析（RIA）和酶聯(lián)免疫分析（ELISA）。RIA 方法具有放射污染性，不易在臨床推廣；ELISA 檢測法因操作程序復(fù)雜，所需時間較長，尤其在早期腫瘤標志物、神經(jīng)性肽等微量蛋白的檢測上，缺乏足夠的靈敏度，限制了其在臨床上的應(yīng)用[3]。因此，對于早期癌癥的腫瘤標記物的檢測方法需要進一步改進，以提高檢測靈敏度。

納米金顆粒具有納米材料所特有的三大效應(yīng)：表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)，日益受到人們的關(guān)注[4]。自 1971 年 Faulk 和 Taylor[5]將兔抗沙門菌抗血清與納米金結(jié)合，用直接免疫細胞化學(xué)技術(shù)檢測表面抗原后，納米金做為一種免疫標記技術(shù)得到了更為迅速和廣泛的發(fā)展。最近報道的基于納米金和微型磁珠的 BCA 擴增技術(shù)（Bio-Bar code assay）是以巰基寡核苷酸和蛋白連接納米金形成納米金生物探針，建立的高靈敏度檢測蛋白的新方法[6-10]。另外，標有辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）的抗體 IgG 標記到納米金顆粒表面，根據(jù)電化學(xué)方法檢測血清蛋白含量，其中 HRP 作為信號擴增作用，可以促進不同的發(fā)光體進行發(fā)光并產(chǎn)生可見的信號[11]。

結(jié)合以上研究，在本研究組前期研究基礎(chǔ)上[12]進一步改良，制備 IgG-Au-HRP 和 IgG-Au-DNAHRP 兩種納米金標記 p53 抗體探針。以 p53 蛋白的檢測為例，對這兩種納米金生物探針的制備技術(shù)進行了研究，并對所制備的納米金生物探針的性能進行了檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 p53 IgG 購自美國 Abcam 公司；巰基化 DNA 鏈 5’（SH）TTTTTTTTTTAgCTACgAgT TgAATCCTgCgTTTTTTTTTT（BIOTIN）3’ 由日本TaKaRa 公司合成；氯金酸（HAuCl4·3H2O）、檸檬酸鈉（trisodium citrate）、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、辣根過氧化物酶（HRP）均購自美國 Sigma-Aldrich公司；實驗用水為二次去離子水。

1.1.2 儀器 JEM 2100 透射電子顯微鏡為日本電子公司的產(chǎn)品；V-60 紫外-可見光光譜儀為日本 Jasco 公司產(chǎn)品；Wallac 1420 多功能酶標儀為美國 PerkinElmer 公司產(chǎn)品；5804R 離心機為德國 Eppendorf 公司產(chǎn)品；硝酸纖維薄膜過濾器（0.22 μm）為美國 Corning Incorporated 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 納米金制備 根據(jù) Frens[13]與 Horisberger和 Rosset[14]介紹的檸檬酸鈉還原方法制備 10 nm直徑的納米金。制備的溶液通過 0.22 μm 的硝酸纖維薄膜過濾器過濾除去一些電解離子和一些聚集的膠體金顆粒。實驗所需相關(guān)玻璃器皿均經(jīng)過多次雙蒸水沖洗，硅化處理（1% 雙氯硅烷/氯仿浸泡1 h，烘干）。

1.2.2 納米金探針制備

1.2.2.1 IgG-Au-HRP 型探針的制備 圖 1A 為IgG-Au-HRP 型探針的標記過程示意圖?？贵w和HRP 分子通過非共價結(jié)合方式吸附到納米金顆粒表面。在蛋白檢測中，被標記在納米金表面的抗體作為識別抗體與待測抗原蛋白識別結(jié)合，從而將待測蛋白分子與作為信號分子的 HRP 分子間接偶聯(lián)在一起，通過 HRP 分子氧化反應(yīng)測得光吸收值，檢測抗原蛋白分子含量。制備過程：取濃度為0.59 × 10-7mol/L 的 10 nm 納米金溶液 1 ml，加入0.2 mol/L 的 K2CO3調(diào)至 pH 為 9.0 左右；加入HRP 與抗體體積比為 10∶1，濃度均為 1 mg/ml 的混合液 66 μl，室溫孵育 1 h；加入 10%（w/v）聚乙二醇（PEG）8 000 50 μl 穩(wěn)定和鈍化膠體金；最后納米金探針用納米金重懸液（0.05 mol/L Tris pH 7.8，含 1.25% 蔗糖，0.2% BSA，0.05% PEG，0.05% PVP，0.15% Tween20）在離心半徑為 9 cm，9 000 r/min、4 ℃條件下，離心 4 ～ 5 次，除去未結(jié)合的抗體和 HRP，加入 400 μl 納米金重懸液重懸納米金探針，4 ℃ 放置備用。

1.2.2.2 IgG-Au-DNA-HRP型探針的制備 圖1B 為 IgG-Au-DNA-HRP 型探針標記過程示意圖。首先抗體通過吸附被標記到納米金顆粒表面，接著巰基化 DNA 鏈通過 Au-S 共價結(jié)合到納米金表面，最后 HRP 分子通過與巰基化 DNA 鏈結(jié)合反應(yīng)，間接連接到納米金顆粒表面。其中 DNA 作為“橋梁”把檢測信號（HRP）連接到納米金顆粒表面。制備過程：0.59 × 10-7mol/L 的 10 nm 納米金溶液 1 ml 調(diào)節(jié) pH 值為 9.0；加入 4 μl（1 mg/ml）抗體，室溫孵育 1 h；隨后加入 10 μl 巰基化 DNA鏈（0.1 mol/L），振蕩搖勻，于 4 ℃ 放置 15 h；加入終濃度為 0.5%（w/v）PEG 8 000 穩(wěn)定探針，室溫放置 48 h 以上；多余的抗體和 DNA 探針通過 9 000 r/min、4 ℃ 離心 50 min 去除；加入 2.5 μl HRP（1 mg/ml）室溫反應(yīng) 1 h；通過納米金重懸液9 000 r/min、4 ℃ 離心 4 ～ 5 次除去未結(jié)合 HRP，沉淀物溶于納米金重懸液中，定容至 400 μl，4 ℃放置備用。

圖 1 新型納米金探針標記過程示意圖Figure 1 Schematic of preparation of the new Au NP probes

1.2.3 納米金探針生物學(xué)特征表征

1.2.3.1 樣品透射電鏡和紫外可見光光譜掃描微量取樣器分別取一定量納米金和納米金探針溶液樣本，加入銅網(wǎng)中，在空氣中干燥，于透射電鏡下觀察；利用紫外可見光光譜進行納米金和納米金探針光度掃描，測定最大吸收波長（λmax）及吸光值（A 值）。

1.2.3.2 納米金上 HRP 分子的定量檢測 納米金探針表面的 HRP 為信號分子，HRP 分子的多少決定了檢測信號的強弱及檢測的靈敏度。10 μl 稀釋不同濃度的納米金探針和 10 μl 已知濃度的標準 HRP 溶液稀釋成不同濃度 HRP 溶液（400、200、100、50、25、12.5、6.25 和 0 ng/ml）分別加入 50 μl TMB 溶液，在避光的條件下 37 ℃ 孵育 10 ～ 15 min，隨后加入 2 mol/L H2SO4終止其顯色反應(yīng)，于 450 nm 處檢測 A450值。根據(jù)已知濃度的 HRP 分子繪制的標準曲線和所測得納米金探針濃度，進行計算、確定標記在納米金探針表面HRP 分子數(shù)量。

1.2.3.3 免疫反應(yīng) 酶聯(lián)免疫反應(yīng)（ELISA 法）檢測 100 ng p53 蛋白進行納米金探針標記各條件的優(yōu)化。包括有待測抗原的單克隆抗體的酶標板與100 ng p53 蛋白反應(yīng)；分別加入同濃度的 IgG-Au-HRP 和 IgG-Au-DNA-HRP 探針于 37 ℃ 孵育30 min；加入 TMB 溶液 37 ℃ 顯色反應(yīng) 10 min； 2 mol/L H2SO4終止其顯色反應(yīng)，于多功能酶標儀450 nm 波長處檢測 A450值。

2 結(jié)果

2.1 納米金生物探針的特征

圖 2 顯示的是透射電鏡掃描觀察納米金顆粒及納米金探針的外貌和單分散性的結(jié)果。制備的納米金溶膠單分散性良好，且顆粒大小較均一，平均直徑約 10 nm（圖 2A），標有蛋白和 DNA 的納米金顆粒沒有發(fā)生聚集，且標記后的納米金顆粒周圍有一圈清晰可見的“暈”環(huán)，與未標記的納米金顆粒周圍清晰界面成鮮明對比（圖 2B，2C），是生物分子已標記到納米金顆粒表面的佐證。用紫外可見光光譜掃描儀對納米金及納米金探針溶液進行光譜掃描（圖 3），未經(jīng)修飾的納米金溶液最大吸收峰在 520 nm（圖 3a），而標記抗體和 HRP 的納米金探針在 524 nm 有最大吸收峰（圖 3b），同時標記抗體和 DNA、HRP 的納米金探針最大吸收峰為526 nm（圖 3c）。

2.2 探針制備條件的優(yōu)化

制備不同納米金探針進行 100 ng p53 蛋白檢測。由圖 4A 可知，隨著 HRP 分子和抗體比例的增大其檢測蛋白的 450 nm 吸收值先增大到一定程度后又減小，可能是由于隨著抗體量的增多，相應(yīng)的 HRP 減少導(dǎo)致檢測信號降低，故選擇 HRP 和p53 抗體的體積比 10∶1 為最佳標記比例。圖 4B顯示的是 IgG-Au-DNA-HRP 探針標記時抗體和巰基化 DNA 鏈加入量的優(yōu)化。同理，巰基化 DNA與 p53 抗體體積比 2.5∶1 是標記的最佳比例。

2.3 探針表面 HRP 分子的數(shù)量

圖 2 納米金和納米金探針 TEM 掃描圖（A：未修飾的納米金顆粒；B：IgG-Au-HRP 型探針；C：IgG-Au-DNA-HRP 型探針）Figure 2 The TEM analysis of the AuNPs and AuNP probes. A: Unmodified gold nanoparticles; B: IgG-Au-HRP probes; C: IgG-Au-DNA-HRP probes

根據(jù)已知濃度 HRP 溶液稀釋成不同濃度HRP 溶液（400、200、100、50、25、12.5、6.25 和0 ng/ml）繪制的以 HRP 濃度為橫坐標，A450值為縱坐標繪制的標準曲線和標記在納米金探針上的 HRP 的檢測活性濃度對比（圖 5），得知標記在IgG-Au-HRP 探針上的 HRP 的濃度為 5.892 × 10-2g/L，并且，由納米金探針 524 nm 處吸收值得出納米金探針濃度為 0.534 × 10-7mol/L，故 HRP和納米金探針的濃度比率為 11.03，這意味著每一個 10 nm 的納米金探針上可以標記（11 ± 1）個HRP 分子，同理在 IgG-Au-DNA-HRP 探針中，每一個納米金探針可標記（20 ± 1）個 HRP 分子。

圖 3 納米金標記前后紫外-可見光譜掃描圖Figure 3 UV-vis spectra for AuNP and AuNP probes

圖 4 納米金探針標記抗體選擇（A：HRP/抗體；B：DNA/抗體）Figure 4 The selection of gold nanoparticle labeled antibody probes. A: HRP to antibody; B: DNA to antibody.

2.4 兩種類型探針蛋白檢測效率比較

同濃度兩種類型納米金探針檢測 100 ng p53蛋白，在幾乎相近空白背景信號情況下，IgG-Au-DNA-HRP 型探針比 IgG-Au-HRP 型探針擁有更高的陽性值（圖 6）。由 HRP 定量檢測計算，得知每一個 IgG-Au-DNA-HRP 探針標有的 HRP 個數(shù)比 IgG-Au-HRP 型探針多約 2 倍，由此可知，IgG-Au-DNA-HRP 型探針 p53 蛋白檢測靈敏度要優(yōu)于 IgG-Au-HRP 型探針。

圖 5 HRP 標準曲線圖Figure 5 Standard curve of HRP

圖 6 兩種探針檢測蛋白靈敏度比較Figure 6 Comparison of the sensitivity in protein detection of two AuNP probes

3 討論

納米金以其獨特的理化性質(zhì)和易于標記等優(yōu)點廣泛應(yīng)用于分子標記領(lǐng)域。以抗體和巰基化DNA 鏈、酶蛋白—— HRP 分子進行標記的新型納米金探針是一種可利用普通的酶標儀進行微量蛋白檢測的新型探針標記方法，為簡易微量蛋白檢測奠定了基礎(chǔ)。實驗表明標記抗體后的納米金探針表面有一層可見的“暈”環(huán)。納米金在 500 ～ 550 nm之間有強的吸收峰，這是納米金的表面等離子共振（surface plasma resonance，SPR）吸收峰[15]，對比納米金標記 p53 抗體前后的紫外一可見吸收光譜，吸收曲線在 520 nm 處的吸光值降低，由此可推測 p53 抗體與納米金發(fā)生了相互作用。同時，可以看到吸收曲線的最大峰值發(fā)生了 4 ～ 6 nm 左右的紅移，根據(jù)報道[16]，當(dāng)納米金與周圍吸附介質(zhì)或基質(zhì)材料相互作用會引起吸收峰發(fā)生紅移。由此可以初步判定 p53 抗體與納米金發(fā)生了相互結(jié)合并且最大吸收峰發(fā)生右移，可見納米金探針標記成功。

沒有修飾蛋白的納米金在高濃度鹽溶液條件下狀態(tài)不穩(wěn)定，當(dāng)加入高濃度鹽溶液時，納米金溶液會發(fā)生聚集，顏色會由紅變藍色，主要是溶液中殘留的負離子在納米金周圍形成負電荷層，在納米顆粒之間形成聚合力的緣故[17]。蛋白可以改變納米顆粒表面的電荷，使修飾后的納米金處于更加穩(wěn)定狀態(tài)，在高濃度鹽溶液中仍保持鮮紅狀態(tài)，不發(fā)生聚集。納米金和寡核苷酸的反應(yīng)須在高濃度的氯化鈉溶液中完成，在 IgG-Au-DNA-HRP 探針標記中，納米金首先修飾抗體后，微粒間的穩(wěn)定性大大提高，利于 DNA 在其表面和納米金顆粒結(jié)合。

該納米金探針表面標記抗體在檢測蛋白時作為“橋梁”，把待檢測抗原和檢測信號（HRP）連接起來，酶分子 HRP 作為檢測信號并起到信號放大作用，同時，HRP 分子通過與巰基化 DNA 鏈進行鏈霉素-生物素反應(yīng)標記到納米金表面，因此檢測抗體和巰基化 DNA 鏈在納米金表面的標記比例對檢測結(jié)果有重要影響。實驗證明 DNA 和 p53抗體的體積比 2.5∶1 為最佳納米金探針制備比例。隨著巰基化 DNA 鏈的增多，相應(yīng)的 HRP 分子標記量增大，免疫檢測光吸收值增加，達到一個峰值后，光吸收值相應(yīng)減少，可能由于過多的巰基化DNA 鏈占據(jù)過多納米金表面位置，結(jié)果檢測抗體的標記量相對減少，無法捕捉足量的待測抗原，最終形成的三明治結(jié)構(gòu)中，HRP 分子的總數(shù)量相對減少，導(dǎo)致檢測信號降低。同理，實驗證明 HRP 與抗體比例為 10∶1 時為最佳制備比例。

納米金把待檢測蛋白相對應(yīng)的抗體與信號分子 HRP 偶聯(lián)在一起，既起到信號放大作用，提高免疫反應(yīng)的檢測靈敏度，還可以簡化操作步驟，更易于在臨床上推廣。典型的間接夾心 ELISA 檢測步驟復(fù)雜，且一個酶標抗體只能結(jié)合 1 ～ 2 個HRP 分子。然而，本實驗制備的納米金探針，一個抗體可以與很多 HRP 分子相偶聯(lián)，從而實現(xiàn)了檢測信號的放大，提高了檢測靈敏度[17]。該納米金探針用于蛋白檢測有以下優(yōu)點：納米金探針仍保留納米金顆粒的獨特物理特性；具有抗體特異性特點；以 HRP 為檢測信號，利用簡單的顯色反應(yīng)檢測蛋白，為微量蛋白的臨床檢測打下了基礎(chǔ)。

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ObjectiveTwo novel p53 antibody gold nanoparticle probes (IgG-Au-HRP probes and IgG-Au-DNA-HRP probes) were synthetized, the biological characteristics of which were studied.

MethodsTwo kinds of novel multifunctional gold nanoparticle probes (IgG-Au-HRP probes and IgG-Au-DNA-HRP probes) were synthesized, the gold nanoparticles were functioned with both antibodies and Horseradish-peroxidase (HRP), which can be immobilized onto gold nanoparticles directly (IgG-Au-HRP probes) or through the thiol-terminated oligonucleotides strand (IgG-Au-DNA-HRP probes). The morphology and spectroscic properties of these probes were evaluated by transmission electron microscopy (TEM), UV-vis spectra analyses and ELISA.

Results①New gold nanoparticles probes were monodisperse, good morphology and dispersed evenly, the average diameter was 10 nm; ②Experimental parameters involved in preparation of IgG-Au-HRP and IgG-Au-DNA-HRP probes were optimized. The ideal ratio of HRP: detecting antibody p53 was 10:1 (IgG-Au-HRP), and the ratio of DNA: detecting antibody p53 was 2.5:1 (IgG-Au-DNA-HRP); ③Based on quantification of HRP immobilized on Au NP probe, the number of HRP molecules was 11 in IgG-Au-HRP probe and was 20 in IgG-Au-DNA-HRP probe; ④From initial detection through ELISA, the sensitivity in protein detection of IgG-Au-DNA-HRP probes was higher than IgG-Au-HRP probes.

ConclusionThe preparation of the new nanoparticle gold probes was simple, which can be used as a new type of probe used in high sensitivity detection of protein.

【Key words】Enzyme-Linked immunosorbent assay; Tumor suppressor protein p53; Horseradish peroxidase; Metal nanoparticles; Biosensing techniques

Author Affiliations: College of Preclinical Medicine and Biological Science, Suzhou University, Suzhou 215123, China (HUANG Yun-yan, ZHAO Lin-chuan); Shanghai Institute of Microsystem and Information Technology, Chinese Academy of Science, Shanghai 200050, China (JIA Chun-ping, LIU Mei-ying, JIN Qing-hui, ZHAO Jian-long)

Chin Med Biotechnol, 2010, 5(3):171-176

Corresponding Authors: JIA Chun-ping, Email: jiachp@mail.sim.ac.cn; ZHAO Lin-chuan, Email: sdzlc2008@126.com www.cmbp.net.cn

基金項目：國家高技術(shù)發(fā)展研究計劃（863 計劃）（2006AA3Z334）；上海市科委納米專項資助項目（0752nm019）

作者單位：215123 蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院（黃云艷、趙林川）；200050 上海，中國科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所納米技術(shù)研究室（劉美英、賈春平、金慶輝、趙建龍）

通訊作者：賈春平，Email：jiachp@mail.sim.ac.cn；趙林川，Email：sdzlc2008@126.com

收稿日期：2009-12-01

DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.03.002

Preparation and characterization of two kinds of gold nanoparticle labled p53 antibody probes

HUANG Yun-yan, JIA Chun-ping, LIU Mei-ying, JIN Qing-hui, ZHAO Jian-long, ZHAO Lin-chuan

【Abstract】