影響豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染與增殖的因素*

韓明遠,沈青春,張志剛,寧宜寶

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所農(nóng)業(yè)部獸用生物制品創(chuàng)制與評價重點開放實驗室,北京 100081)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine rep roductive and respiratory syndrom e,PRRS)是豬群中流行的重要的傳染病之一,可引起母豬的繁殖障礙(包括流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等)、仔豬成活率急劇下降和育成豬呼吸道癥狀等。病原為豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV),該病毒為單股正鏈RNA病毒,與馬動脈炎病毒(Equine arteritis virus,EAV)、鼠乳酸脫氫酶升高癥病毒(Lactate dehydrogenase elevating virus,LDV)及猴出血熱病毒(Simian hemorrhagic fever virus,SHFV)同屬于動脈炎病毒屬[1]。

雖然PRRSV在感染豬脾臟、肝臟、派伊爾氏淋巴集結(jié)以及胸腺中均有發(fā)現(xiàn),但是PRRSV具有嚴格的細胞嗜性,在體內(nèi)主要感染豬肺巨噬細胞(porcine alveolarmacrophages,PAM)。其他細胞系如MA 104細胞、Marc-145細胞及CL2621細胞,多用于PRRSV體外增殖。與其他囊膜病毒感染細胞的過程相似,PRRSV需要首先與細胞受體結(jié)合,通過內(nèi)吞作用進入細胞內(nèi),在胞內(nèi)完成病毒的脫殼與基因組釋放。PRRSV侵入細胞的機制與影響因素被研究人員所關注,自1998年段小波發(fā)現(xiàn)第1個PRRSV受體以來,多個PRRSV受體以及相關大分子物質(zhì)被發(fā)現(xiàn)。到目前為止,包括細胞受體、胞內(nèi)大分子物質(zhì)和細胞因子在內(nèi)的多個因素被證明能夠影響PRRSV感染宿主細胞與在宿主細胞中增殖。

1 細胞受體

大多數(shù)病毒侵入宿主細胞首先要與細胞受體相互作用,使病毒富集于細胞表面,隨后細胞受體介導病毒進入細胞質(zhì)中或?qū)⑾嚓P信號傳入細胞內(nèi)部使病毒完成與細胞膜的融合[2]。為了解釋PRRSV細胞嗜性的機制,人們一直在 PRRSV靶細胞中尋找PRRSV受體。K reutz LC[3]認為PRRSV細胞嗜性的決定性因素在于宿主細胞膜上的相關因子。目前在PAM與Marc-145中發(fā)現(xiàn)了多個PRRSV細胞受體,并且證明細胞受體在PRSSV進入細胞的過程中所起十分重要的作用。

1.1 PAM 中的PRRSV受體

唾液酸黏附素(sialoadhesin,Sn)在許多情況下能夠幫助病原體感染宿主細胞。例如,能夠表達Sn的CD14+單核細胞能夠與人類免疫缺陷病毒(Hum an immunodeficiency virus,H IV)囊膜糖蛋白gp120上唾液酸殘基發(fā)生相互作用,從而介導H IV感染細胞。與H IV將Sn作為細胞受體所不同,人鼻病毒(Human rhinoviruses,H RV)通過誘導樹突狀細胞(dend ritic cells,DC)表達Sn以抑制樹突狀細胞部分功能,從而在HRV感染機體后下調(diào)機體的適應性免疫應答水平[4-5]。

Sn也能夠幫助PRRSV進入靶細胞中,并且試驗證實Sn是PRRSV的受體。段小波最早使用能夠阻斷PRRSV感染PAM的單克隆抗體M b41D3與PAM作用,通過免疫沉淀的方法在PAM中找到了一個分子質(zhì)量約為210 ku的細胞膜蛋白,并確定該蛋白為PRRSV受體。但該試驗沒有對該蛋白作進一步的分析,蛋白具體信息不明[6]。在隨后的研究中通過對該210 ku蛋白進行胰蛋白酶消化,并對得到肽段用質(zhì)譜方法得到蛋白序列,隨后與蛋白數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)比對證明該210 ku蛋白為Sn[7]。雖然Sn能夠介導PRRSV進入PAM,PRRSV也可以通過Sn非依賴性途徑感染宿主細胞,但該途徑只在特定細胞系中進行[8]。

在發(fā)現(xiàn)肝素可以抑制PRRSV感染M arc-145細胞之后,Delputte P L等[9]通過研究發(fā)現(xiàn)PAM表面存在的硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)能夠與PRRSV相互作用,隨后證實HS是PRRSV的受體,同時發(fā)現(xiàn)PRRSV中以M-GP5復合物形式存在的病毒基質(zhì)蛋白是HS受體的主要結(jié)合位點。

確定Sn和HS為PRRSV受體后,Delputte P L等[10]通過試驗發(fā)現(xiàn)肝素與m Ab41D3在共同作用下完全可以阻斷PRRSV感染PAM。他認為只有這兩種受體參與PRRSV感染PAM的過程。根據(jù)后續(xù)試驗結(jié)果,Delputte P L認為 PRRSV感染PAM的早期首先與HS進行相互作用,使PRRSV在PAM的表面富集,進而促進PRRSV與Sn的相互作用,完成病毒的內(nèi)化。

雖然在上述兩種受體的作用下,PAM可以內(nèi)化PRRSV,但是PRRSV基因組并沒有在細胞質(zhì)中釋放,這說明還需要某種因子幫助PRRSV釋放基因組,以使PRRSV在PAM中能夠引起增殖性感染[9]。

1.2 Marc-145細胞中的PRRSV受體

雖然Jusa E R等通過試驗發(fā)現(xiàn)肝素可以阻止PRRSV感染M arc-145細胞,但是 Kim JK等[11]認為PAM中的PRRSV受體Sn與HS并不能夠在Marc-145細胞中表達。可見 PRRSV侵入 M arc-145細胞的途徑與豬肺巨噬細胞所采取的途徑截然不同。

Kim JK等[11]研究發(fā)現(xiàn)M arc-145細胞中的波形蛋白(vimentin)為PRRSV受體。波形蛋白為中間纖維的主要成分。中間纖維大致分為五類,分別為角蛋白纖維、波形纖維、結(jié)蛋白纖維、神經(jīng)元纖維和神經(jīng)膠質(zhì)纖維。微絲(m icrofilam ent,MF)、微管(m icrotubule)與中間纖維(intermediate filament,IF)構(gòu)成了細胞質(zhì)骨架體系。除了構(gòu)成細胞結(jié)構(gòu)之外,波形蛋白在外源病毒侵入宿主細胞的過程中也起到了重要作用。Kim JK在試驗中使用能夠阻斷PRRSV感染 M arc-145細胞的單克隆抗體 7G10(7G10MAb)與M arc-145細胞作用后,通過二維電泳和質(zhì)譜分析的方法,發(fā)現(xiàn)與7G10MAb結(jié)合的蛋白復合物由7種蛋白構(gòu)成,而通過Western b lot發(fā)現(xiàn)只有波形蛋白能夠與7G10MAb直接結(jié)合。隨后證實PRRSV可與波形蛋白發(fā)生結(jié)合,當將波形蛋白轉(zhuǎn)入PRRSV非受納細胞BHK之后,PRRSV可以感染該細胞,證明了波形蛋白為PRRSV的受體。同時該試驗還證明M arc-145細胞的表面以及細胞質(zhì)中均存在波形蛋白,且MARC-145波形蛋白的表達受PRRSV的調(diào)控。值得注意的是波形蛋白是重要的磷蛋白,能被多種蛋白激酶磷酸化,磷酸化作用可能會影響到波形蛋白的性質(zhì)。例如磷酸化后的波形蛋白被高爾基體分泌到體外后會與病原發(fā)生作用,而波形蛋白的磷酸化可能與PRRSV嚴格的細胞嗜性有關。雖然波形蛋白被認為是PRRSV受體,但沒有實驗證明波形蛋白是否會引起病毒在細胞內(nèi)的增殖性感染[11]。

除了受體作用外,完整的細胞骨架對于PRRSV在M arc-145細胞之間傳播十分重要。當能夠破壞完整細胞骨架的秋水仙素與細胞松弛素B共同作用于M arc-145細胞時,PRRSV的感染率下降。通過實驗,Cafruny W A等[12]認為PRRSV感染Marc-145細胞分為兩個過程,感染的初始階段只發(fā)生在特定范圍的細胞之中;在感染中后期,病毒由已感染細胞向未感染細胞進行傳播。

1.3 Toll樣受體

Toll樣受體(toll like recep tor,TLR)在先天性免疫應答中所起到十分重要的作用,通過與其他模式識別受體(pattern recognition receptors,PRRs)共同作用,對侵入機體病原微生物中存在的病原相關分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAM PS)進行識別,繼而激活特定信號通路,使宿主細胞產(chǎn)生針對病原的防御作用。目前至少有10種TLR已經(jīng)在人類和小鼠中發(fā)現(xiàn)[13]。

宿主細胞可以利用多種PRRs對PAMPs進行識別以誘導抗病毒應答,其中最主要的就是TLR。TLR3、TLR7、TLR 8和 TLR 9似乎構(gòu)成了針對病毒病原相關分子模式的TLR亞群,其中TLR3識別病毒雙股RNA(dsRNA),TLR7和TLR8識別來源于病毒基因組的dsRNA片段,TLR9則是識別在細菌與病毒中都常見的CpG基序。TLR通過MyD88依賴性信號通路或M yD88非依賴性信號通路,調(diào)控相關細胞因子的表達水平,從而完成對病毒的抑制作用[14]。

與Sn、Hs以及波形蛋白介導PRRSV感染靶細胞的作用不同,TLR3的表達能夠抑制PRRSV感染PAM與M arc-145細胞。在近期的研究中,能夠作為TLR3配體的 dsRNA Poly(I:C)被用于研究TLR3作用。這種人工合成dsRNA的使用能夠上調(diào)TLR3表達,繼而促進細胞IFN-r的合成,從而抑制PRRSV對細胞的感染[13]。

2 胞內(nèi)大分子物質(zhì)

雖然試驗證明在PRRSV感染靶細胞的過程中PRRSV受體不可缺少,但是根據(jù)目前研究來看,PRRSV細胞受體只能幫助PRRSV通過內(nèi)吞作用進入細胞質(zhì)中,而病毒脫殼與病毒基因組的釋放則需要在胞內(nèi)大分子的協(xié)同作用下完成。

2.1 CD163

CD163分子是清道夫受體(scavenger receptor,SR)蛋白家族的一員。SR蛋白包括大量位于細胞表面的可溶性糖蛋白,這些糖蛋白可與配體識別,從而調(diào)節(jié)免疫應答水平。Calvert JG等[8]通過試驗證實CD163分子在PRRSV感染M arc-145細胞的過程中起到了重要作用。將CD163在其他PRRSV非受納細胞中的表達,能夠促進PRRSV對這些細胞的感染,并產(chǎn)生病毒增殖能力。

PAM表面的CD163分子有助于PRRSV感染PAM。Van Gorp H等[15]通過研究發(fā)現(xiàn)當CD163特異性單克隆抗體與巨噬細胞在37℃下孵育后,PRRSV感染宿主細胞的效率下降了75%。而將抗CD163與抗Sn的抗體共同與PAM細胞進行孵育時可以完全阻斷PRRSV感染。通過共聚焦顯微鏡分析,PRRSV與僅表達Sn的細胞作用時,只發(fā)生病毒顆粒的內(nèi)化,但是不會發(fā)生病毒顆粒的脫殼。當PRRSV感染Sn與CD163共表達的細胞時,病毒顆粒的內(nèi)化與病毒的脫殼同時發(fā)生,并且感染效率與單一表達CD 163的細胞相比要高10倍～100倍。通過上述實驗Van Gorp H認為,CD163能夠增加病毒感染宿主細胞的能力,但CD 163不是一個細胞受體,CD163只是介導PRRSV在細胞質(zhì)中脫殼,并將病毒基因組釋放。

綜上所述,PRRSV在感染PAM的過程如下:PRRSV的基質(zhì)蛋白(M蛋白)首先與PAM表面的HS發(fā)結(jié)合,使病毒顆在PAM表面富集。隨后病毒顆粒上的唾液酸與PAM表面Sn受體相互作用共同完成病毒顆粒的內(nèi)化。病毒內(nèi)化后被轉(zhuǎn)運到PAM細胞質(zhì)中,細胞質(zhì)中的pH低,而pH降低是病毒脫殼的必要條件。PRRSV在細胞內(nèi)CD163分子的協(xié)同作用下完成脫殼,將病毒的基因組釋放,使PRRSV在PAM中可以完成增殖性感染。

2.2 CD151

CD151也被認為在PRRSV感染靶細胞的過程中起到了重要作用。表達CD151的BHK細胞會出現(xiàn)PRRSV增殖性感染。同時對M arc-145細胞中的CD151的基因進行siRNA干擾,可抑制PRRSV感染M arc-145細胞的水平。CD151提升 PRRSV感染M arc-145細胞的能力主要是由于PRRSV 3′端非轉(zhuǎn)錄區(qū)(3′UTR)與CD151的發(fā)生結(jié)合導致[16]。

3 細胞因子的作用

3.1 干擾素對于PRRSV感染的影響

干擾素(interferon,IFN)在先天性免疫應答中所起十分重要的作用。干擾素分為Ⅰ型和Ⅱ型兩種,其中Ⅰ型干擾素包括IFN-α、IFN-β,Ⅱ型干擾素為IFN-γ。通過調(diào)控數(shù)百種基因的轉(zhuǎn)錄水平,IFN誘導產(chǎn)生具有抗病毒作用的蛋白質(zhì),這些蛋白質(zhì)包括蛋白質(zhì)激酶(protein kinase,PKR)、2′,5′-寡腺苷酸合成酶(2′,5′-oligadeny late synthetase,OAS)和核糖核酸酶L(RNase L)、RNA特異性腺苷脫氨基酶(RNA-specific adenosine deaminase,ADAR)和M x蛋白。

PRRSV侵入機體之后,最初的免疫應答發(fā)生在被感染巨噬細胞中。在這些細胞中出現(xiàn)的dsRNA在胞內(nèi)會引起一系列的級聯(lián)反應,一般是以Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生為標志。IFN-α能夠抑制病毒在靶細胞內(nèi)的復制,這主要是通過M x1蛋白起到抗病毒作用[17]。不同毒株對于IFN-α的敏感性不同,且誘導PAM產(chǎn)生IFN-α的能力也存在差異[18]。重組IFN-β可以抑制PRSSV感染PAM與Marc-145細胞[19]。值得注意的是PRRSV會抑制 IFN-a的分泌。PRRSV感染M arc-145細胞后,也不會產(chǎn)生Ⅰ型干擾素[20-21]。

雖然IFN-α具有抗病毒作用,但是Delputte P L等[22]認為使用IFN-α治療會上調(diào)單核細胞中Sn表達,從而促進PRRSV感染單核細胞的能力。

PRRSV感染機體之后,血清中存在 IFN-γ,而在外周血單核細胞(PBMCs)、肺以及淋巴結(jié)中均發(fā)現(xiàn)了IFN-γ的mRNA[23]。雖然PRRSV在感染機體之后T細胞介導的IFN-γ應答水平逐漸升高,但是整體水平較為微弱[24]。IFN-γ既能夠抑制PRRSV在PAM中的復制也可以阻斷PRRSV在Marc-145細胞中的增殖。但是使用雙股RNA誘導蛋白激酶的抑制劑 2-氨基嘌呤之后可以恢復PRRSV在M arc-145細胞中的增殖情況,說明IFNγ主要通過PKR途徑抑制病毒增殖[12]。

3.2 IL-12

IL-12是促進細胞免疫、誘導T細胞以及NK細胞產(chǎn)生的IFN-γ重要物質(zhì)。有報道稱重組的IL-12能夠介導PAM 產(chǎn)生IFN-γ,體外使用IL-12可以降低PAM中PRRSV的病毒滴度。IL-12已被用作PRRSV滅活疫苗與DNA疫苗的佐劑[25]。

4 小結(jié)

根據(jù)目前的相關報道,宿主細胞受體、胞內(nèi)大分子物質(zhì)以及細胞因子都會影響PRRSV感染宿主細胞與在宿主細胞增殖的過程。與多數(shù)病毒侵入細胞的過程相似,PRRSV在感染宿主細胞過程中需要細胞受體完成病毒顆粒在宿主細胞表面的富集與內(nèi)化過程,這對于 PRRSV的進入宿主細胞十分重要。同時,胞內(nèi)大分子物質(zhì)在病毒脫殼以及病毒遺傳物質(zhì)釋放過程中的發(fā)揮重要作用,目前的研究發(fā)現(xiàn)只有CD163和CD151分子涉及該過程。細胞因子對于PRRSV感染宿主細胞的抑制作用雖然不具有特異性,但是其作用不可忽視,部分研究中已經(jīng)將細胞因子做為PRRSV疫苗佐劑使用以提升疫苗的效力。

目前用于研究影響病毒感染與增殖因素的技術較為成熟,但是仍存在一些問題制約相關研究。獲取特異性的單克隆抗體對于細胞受體的發(fā)現(xiàn)十分重要,所有的PRRSV受體的發(fā)現(xiàn)都是通過單克隆抗體與細胞受體的特異性反應。同時,大分子物質(zhì)的胞內(nèi)定位技術也十分重要,雖然研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了兩種大分子物質(zhì)參與了PRRSV感染與增殖的過程,但是這兩種大分子物質(zhì)在胞內(nèi)的具體位置需要通過定位技術確定,從而能夠系統(tǒng)地了解病毒進入宿主細胞的整個過程。除了技術層面之外,基礎研究整體水平的上升對于進一步研究影響PRRSV感染與增殖的因素十分關鍵。

研究影響PRRSV感染與增殖的因素,就預防與合理利用PRRSV而言十分關鍵。由于PRRSV感染機體初期,對PRRSV的抑制主要依賴于機體的抗病毒能力以及先天性免疫應答水平,在此時期通過抑制、阻斷使PRRSV進入機體的因素或許會有效抑制病毒感染宿主。例如可以使用單克隆抗體封閉宿主細胞表面的PRRSV受體,使PRRSV無法與宿主細胞表面受體結(jié)合,從而病毒無法在宿主細胞表面完成富集與內(nèi)化,以達到抑制PRRSV感染宿主細胞的目的。此外,PRRSV感染宿主具有持續(xù)性的特點,利用PRRSV感染的持續(xù)性將PRRSV改造成表達載體的研究較多,通過在表達系統(tǒng)中添加促進PRRSV感染的因素,可以改善PRRSV在宿主細胞的增殖狀況,以提高目的蛋白的表達量。根據(jù)目前的研究,通過在表達系統(tǒng)中加入胞內(nèi)大分子物質(zhì)或者共表達該類大分子物質(zhì),可使PRRSV產(chǎn)生增殖性感染,實現(xiàn)提高蛋白表達產(chǎn)量的目的。

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