細(xì)胞生長因子在小動物角膜損傷修復(fù)中的作用*

丁 一,王 瓊,陳建國,程莉莉,吳儀強(qiáng),熊 成,周敏燕,魏 嘉

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,湖北武漢 430070)

細(xì)胞生長因子在小動物角膜損傷修復(fù)中的作用*

丁 一,王 瓊,陳建國*,程莉莉,吳儀強(qiáng),熊 成,周敏燕,魏 嘉

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,湖北武漢 430070)

小動物(尤其犬和貓)角膜損傷在獸醫(yī)臨床上十分常見。角膜損傷治療不當(dāng)或愈合延遲會導(dǎo)致視力障礙,甚至失明。研究表明,在角膜損傷的修復(fù)中細(xì)胞生長因子有成纖維細(xì)胞生長因子、表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子-β、角質(zhì)細(xì)胞生長因子、血小板衍生生長因子和神經(jīng)生長因子等,起著重要的調(diào)節(jié)作用。這些細(xì)胞生長因子通過自分泌或旁分泌作用于角膜組織細(xì)胞相應(yīng)受體,并經(jīng)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響其下游產(chǎn)物的表達(dá),調(diào)控角膜細(xì)胞的增殖、遷移、分化和凋亡。細(xì)胞生長因子及其受體在角膜組織各層的分布、數(shù)量和作用的時序性差異決定著損傷角膜的有效修復(fù)。體內(nèi)及體外研究顯示,細(xì)胞生長因子將在小動物臨床上有廣闊的應(yīng)用前景。

細(xì)胞生長因子;角膜損傷修復(fù);犬;貓

近十多年來,隨著我國寵物飼養(yǎng)數(shù)量的不斷增加,獸醫(yī)臨床接診犬貓的眼病中因機(jī)械性或感染性因素引起角膜損傷的病例逐漸增多。同時,眼部手術(shù),如白內(nèi)障手術(shù)、青光眼手術(shù)、角膜清創(chuàng)手術(shù)、角膜表層切除手術(shù)也逐漸開展起來。這些手術(shù)也伴隨角膜損傷的發(fā)生。角膜損傷治療不當(dāng)或愈合延遲會導(dǎo)致角膜混濁、潰瘍、穿孔、色素沉著或失明。

目前,角膜損傷治療的藥物十分有限,除抗病毒和抗菌藥物外,臨床上使用的主要為糖皮質(zhì)激素類藥物。但此類藥物因降低角膜上皮細(xì)胞增殖率,不適宜于治療角膜損傷[1]。因此,探索眼角膜損傷有效治療方法是人醫(yī)和獸醫(yī)眼科界關(guān)注的熱點。人們已對小動物(特別是實驗動物)細(xì)胞生長因子及其受體在角膜各層中的分布、細(xì)胞因子作用的途徑,以及它們在修復(fù)中的不同作用進(jìn)行過大量深入的研究,結(jié)果顯示細(xì)胞生長因子在角膜損傷愈合中具有重要作用。

1 角膜損傷與修復(fù)特點

角膜是一種無血管的透明組織,由上皮層、基質(zhì)層和內(nèi)皮層組成。另外,還存在兩種重要的膜,即在上皮層與基質(zhì)層間的Bowman膜(又叫前彈力層)和基質(zhì)層與內(nèi)皮層間的Descemet膜(又叫后彈力層)。角膜上皮細(xì)胞由5層～7層構(gòu)成,正常情況下底層角膜上皮細(xì)胞分化、逐漸向上層遷移,取代脫落的表層角膜上皮細(xì)胞?，F(xiàn)認(rèn)為當(dāng)角膜受到損傷時,損傷信號被傳導(dǎo)至位于角膜緣的角膜干細(xì)胞,角膜干細(xì)胞增殖、分化,并向受損區(qū)遷移[2]。一旦增殖的角膜細(xì)胞完全覆蓋受損區(qū)后,角膜干細(xì)胞可能通過“角膜上皮細(xì)胞的接觸抑制機(jī)制”停止角膜上皮細(xì)胞的增殖活動[3]。角膜前彈力層在一定程度上可抵御機(jī)械性和病理性損傷。一旦前彈力層破壞,愈合后形成不透明的疤痕組織,影響角膜透明。角膜后彈力層也具有一定的抗損傷能力和再生能力。貓、靈長類等角膜內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力低,受損的角膜內(nèi)皮層主要依賴現(xiàn)存角膜內(nèi)皮細(xì)胞的膨大、移位而非有絲分裂的方式參與對損傷的修復(fù)[4-5]。在角膜損傷的修復(fù)過程中,細(xì)胞生長因子,如成纖維細(xì)胞生長因子、表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子β、角質(zhì)細(xì)胞生長因子、血小板衍生生長因子和神經(jīng)生長因子,起著復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用[3]。

2 細(xì)胞生長因子分布、表達(dá)及其作用

細(xì)胞生長因子是指具有促進(jìn)細(xì)胞增殖分裂作用的細(xì)胞因子。一般情況下,細(xì)胞生長因子以一定含量維持角膜組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。當(dāng)角膜組織受損后,其分泌量發(fā)生變化,從而引起對角膜層細(xì)胞增殖、分化、移行的促進(jìn)或抑制作用。不同細(xì)胞生長因子的分布和作用特點是有差異的,正是這種差異使其調(diào)控作用呈復(fù)合立體式的特點。

2.1 成纖維細(xì)胞生長因子

在20世紀(jì)40年代,人們從動物腦中發(fā)現(xiàn)有一種促進(jìn)纖維細(xì)胞增殖的物質(zhì),20世紀(jì)70年代從牛垂體中純化出該物質(zhì),并命名為成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)。FGF有兩種形式,即堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)和酸性成纖維細(xì)胞生長因子(aFGF)。它們在結(jié)合硫酸類肝素蛋白多糖后被激活,結(jié)合后的生長因子不被降解,使之能夠結(jié)合到高親和力細(xì)胞表面受體酪氨酸激酶上。bFGF為17 ku～20 ku的多肽,其活性比aFGF高10倍～100倍,分布于角膜上皮、基質(zhì)、內(nèi)皮和眼房液中,具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、移行和分化作用[6]。研究表明,bFGF在體內(nèi)或體外能促進(jìn)多種動物角膜上皮創(chuàng)傷的愈合[7]。但Foreman D M 等[8]采用體外角膜培養(yǎng)法研究顯示bFGF對牛和人角膜上皮增殖沒有明顯影響。這些報道的差異可能與研究的動物種屬、采用的細(xì)胞系或細(xì)胞來源、靶細(xì)胞的發(fā)育或分化狀態(tài)、細(xì)胞密度、細(xì)胞因子濃度、有無其他細(xì)胞因子存在、培養(yǎng)方法和條件等因素不同有關(guān)。

堿性成纖維細(xì)胞生長因子在犬和貓角膜損傷愈合中的作用研究報道較少。Changmin H等[9]采用不同濃度bFGF作用于體外培養(yǎng)的犬角膜上皮細(xì)胞,以MT T法檢測細(xì)胞增殖率,發(fā)現(xiàn)1 ng/mL～100 ng/mL bFGF均有促犬角膜上皮增殖作用,其中10 ng/mL bFGF效果最好。然而,體外的單層細(xì)胞培養(yǎng)并不能提供生理環(huán)境下的角膜成份細(xì)胞,因角膜是由多層而非單層細(xì)胞構(gòu)成、角膜細(xì)胞與對其具有重要相互作用的角膜基質(zhì)細(xì)胞緊密接觸以及角膜上皮細(xì)胞具有的“中心遷移”作用。為了進(jìn)一步證實bFGF在犬體內(nèi)對角膜損傷愈合的促進(jìn)作用,Hu C等[10]采用角膜圓鋸創(chuàng)傷模型,以熒光素染色法觀察角膜愈合率,對bFGF局部應(yīng)用效果進(jìn)行了研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)bFGF對角膜上皮創(chuàng)傷愈合的促進(jìn)作用在100 ng/mL～1 000 ng/mL濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性。由于淚液和基質(zhì)層中還存在其它細(xì)胞因子(如表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子-β),bFGF在體內(nèi)促角膜創(chuàng)愈合作用可能是其單獨或與其它細(xì)胞因子共同作用的結(jié)果。

bFGF是一個多效性細(xì)胞生長因子,對多種細(xì)胞(包括血管和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞)均具有活性作用,能誘導(dǎo)組織血管增殖反應(yīng)[11]。新生血管形成在角膜創(chuàng)愈合過程中有不利影響,如角膜透明度降低、角膜色素沉著[12]。Hu C等[10]觀察到bFGF作用的犬角膜創(chuàng)在7 d內(nèi)均已愈合,沒有新生血管的形成?？梢娫诙唐趦?nèi)應(yīng)用bFGF并不會導(dǎo)致犬角膜血管的形成,但若長期使用可能有不利影響出現(xiàn)。

2.2 表皮生長因子

表皮生長因子(epidermal grow thfactor,EGF),是一種小分子多肽物質(zhì)(6 045 ku),在淚腺中含量較高。研究表明,表皮生長因子受體分為高親和性受體和低親和性受體;除了角膜基質(zhì)層只存在低親和性受體,上皮層和內(nèi)皮層都含有兩種受體,上皮層以高親和性受體為主,而內(nèi)皮層則相反[13]。顯然,EGF主要在角膜上皮對其生長起促進(jìn)作用。角膜上皮的表皮生長因子受體(EGFR)在角膜緣基底細(xì)胞中的含量比中心基底細(xì)胞高4倍～5倍,在角膜上皮損傷后緣上皮細(xì)胞的增殖能力遠(yuǎn)高于角膜中心細(xì)胞[14]。這與角膜上皮受損后,首先是通過角膜緣干細(xì)胞增殖使受損區(qū)域周圍細(xì)胞移行以覆蓋受損區(qū)域這個特點一致。抑制 EGFR的活體試驗顯示EGFR能維持角膜厚度,而且這種作用不僅是通過淚液中EGF,而且還是通過角膜層中的EGF和TGF-α活動引起;特異的抑制EGFR只能延遲而不能阻止角膜的愈合,這是因為在角膜上皮中還有其它細(xì)胞生長因子的作用[15]。

在體內(nèi)和體外模型系統(tǒng)中,EGF通過促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞移行和有絲分裂來促使角膜損傷愈合。在體外,EGF在濃度大于0.1 ng/mL時以劑量依賴性的方式促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞增殖[16-17]。在體內(nèi),EGF局部運用濃度在10 μ g/mL～20 μ g/mL時能改善角膜愈合速率[18],在 10 μ g/mL～ 50 μ g/mL 時能在角膜低密度區(qū)促進(jìn)上皮細(xì)胞移行,并且對促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(extrocellular matrix,ECM)相互作用和纖連蛋白底物關(guān)聯(lián)的趨觸性移行也有重要作用[19]。

2.3 角質(zhì)細(xì)胞生長因子

角質(zhì)細(xì)胞生長因子(keratinocyte growth factor,KGF)為FGF家族中的一員,由一條大約28 ku的多肽鏈組成。它在上皮組織來源的基質(zhì)層細(xì)胞中廣泛表達(dá),能特異地促使角質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞有絲分裂。KGF與肝素結(jié)合可導(dǎo)致肝素在間質(zhì)的ECM中沉積,并且在ECM中儲存和調(diào)節(jié)釋放。

KGF受體mRNA在角膜上皮中含量較高,但在基質(zhì)層的角質(zhì)細(xì)胞中不存在或含量較低。相反,KGF的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物存在于被培養(yǎng)的基質(zhì)層細(xì)胞而不是上皮細(xì)胞[13]。由此表明,這種細(xì)胞生長因子由基質(zhì)層細(xì)胞產(chǎn)生,且以旁分泌的形式作用于上皮細(xì)胞。在體外添加10 ng/mL～100 ng/mL KGF能促使角膜上皮細(xì)胞DNA合成和細(xì)胞生長,但對細(xì)胞移行和分化沒有明顯作用[21]。在未受損的角膜,基質(zhì)層細(xì)胞持續(xù)低量的表達(dá)KGF,維持角膜上皮功能,而且這種維持還被淚腺產(chǎn)生的KGF所加強(qiáng)[22]。應(yīng)用KGF滴眼,對上皮重生以及缺失基質(zhì)的角膜潰瘍治療有較好效果[13]。

2.4 轉(zhuǎn)化生長因子

轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factorβ,TGF-β)家族包括 TGF-β1、TGF-β2和 TGF-β3,由多種組織產(chǎn)生的25 ku多肽,通常是以一種非活化的形式被細(xì)胞分泌出來,與ECM高親和性結(jié)合產(chǎn)生隱性生長因子群。細(xì)胞外或細(xì)胞膜結(jié)合酶對該復(fù)合物進(jìn)行蛋白水解,使生長因子激活。激活的TGF-β與配體TGF-β糖蛋白受體Ⅰ和Ⅱ結(jié)合,有時還會有TGF-β受體Ⅲ輔助結(jié)合。

TGF-β2前 mRNA在角膜的各種細(xì)胞中都存在,而 TGF-β1前 mRNA在3個角膜層中只有少量被檢測出,TGF-β3幾乎在角膜中不存在[13]。這顯示TGF-β2在角膜中發(fā)揮主要作用。TGF-β受體定位在角膜基質(zhì)層細(xì)胞,而角膜上皮緣和中心也有不等量的3種受體[22]。

TGF-β在體外和體內(nèi)作為肌纖維母細(xì)胞的關(guān)鍵調(diào)控物早已為人們所知。TGF-β來源于角膜上皮和淚液。在正常無損傷的角膜,上皮的基底膜限制TGF-β進(jìn)入基質(zhì)。一旦損傷發(fā)生,結(jié)構(gòu)和功能被破壞的基底膜使該生長因子持續(xù)滲入基質(zhì)。TGF-β的功能活動依賴目的細(xì)胞類型、細(xì)胞分化狀態(tài)、細(xì)胞外環(huán)境和其它細(xì)胞因子存在。它對許多細(xì)胞過程有寬范圍和相反作用的特點。在體外添加1 ng/mL TGF-β可誘導(dǎo) EGF高親和力受體的表達(dá),增強(qiáng)EGF對角膜上皮細(xì)胞生長的促進(jìn)作用[23]。TGF-β還能較弱地抑制EGF介導(dǎo)的上皮細(xì)胞移行作用,較強(qiáng)地抑制由KGF介導(dǎo)的角膜上皮細(xì)胞生長作用[13]。在角膜損傷愈合的過程中,TGF-β還影響細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生、移行和細(xì)胞粘連。TGF-β在促進(jìn)ECM產(chǎn)生的同時,也抑制ECM 蛋白質(zhì)水解和裂解,可使細(xì)胞外基質(zhì)網(wǎng)狀聚集,促進(jìn)疤痕形成[23-24]。

2.5 血小板源性生長因子

血小板源性生長因子(platelet derived growth factor,PDGF)是一種由A和B兩種肽鏈組成的多肽生長因子,以同型二聚體(AA或BB)和異源二聚體(AB)兩種相互聯(lián)系又有區(qū)別的多肽作為功能單位。PDGF與它的酪氨酸激酶受體結(jié)合調(diào)控其效應(yīng)。同樣,其受體也有α和β兩種形式,受體α與A和B兩條鏈同時結(jié)合,而β受體優(yōu)先結(jié)合B鏈。

PDGF存在于淚液和角膜上皮中,其受體在于角膜基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞[25]。PDGF是一種促有絲分裂和趨化性的因子,調(diào)控角膜愈合功能,如基質(zhì)細(xì)胞增殖和移行。與TGF-β相似,在正常情況下上皮的基底膜隔絕了其配體和受體的相互作用。上皮基底膜受損后,這些生長因子滲入基質(zhì)層誘導(dǎo)前體細(xì)胞分化為肌纖維母細(xì)胞[25]。

在角膜損傷的動物模型中,利用一種表達(dá)PDGF受體β的帶有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)固著信號的質(zhì)粒載體(pCMV.PDGFRB.3KDEL),使 PDGF 阻斷,可通過α平滑肌肌動蛋白(α SMA)含量確定肌纖維母細(xì)胞的密度和評價角膜混濁程度。PDGF與 TGF-β一起,參與基質(zhì)層和上皮的相互作用,調(diào)控肌纖維母細(xì)胞增殖,進(jìn)而影響角膜基質(zhì)層的透明。目前,還不能解釋在PDGF被阻斷的基質(zhì)中,為什么基質(zhì)渾濁的增加沒有和α SMA+肌纖維母細(xì)胞密度增加相平行[26]。這可能需要我們進(jìn)一步從肌纖維母細(xì)胞分化過程中去尋找線索。另外,PDGF受體α和 α-SMA的雙重免疫組化表明,在受損角膜基質(zhì)中PDGF受體α主要在上皮基底膜下α-SMA陽性的肌纖維母細(xì)胞中表達(dá)[27]。

2.6 神經(jīng)生長因子

神經(jīng)生長因子(nerve grow th factor,NGF)是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中最早被分離的最具特色的一種因子。它不僅維持感覺神經(jīng)元生存,而且對非神經(jīng)細(xì)胞也有影響。NGF存在于淚液和角膜上皮中,對角膜上皮細(xì)胞功能的維持和角膜損傷愈合起重要作用。證據(jù)顯示NGF3和NGF4、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體存在于角膜,能促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖[28]。

NGF和它的高親和力受體存在于三個角膜層,尤其是上皮和內(nèi)皮層[28]。研究表明NGF和受體在犬淚腺和第三眼瞼中存在,角膜上皮受損后它們的量增加[29]。除了影響角膜上皮細(xì)胞,NGF在角膜損傷時能夠誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞分化為肌纖維母細(xì)胞,促進(jìn)金屬蛋白酶-9表達(dá)激活和膠原凝膠收縮。NGF和TGF-β一起雙向控制成纖維細(xì)胞。在體內(nèi),局部應(yīng)用NGF,伴隨感覺神經(jīng)的修復(fù),角膜潰瘍也迅速愈合[30]。

3 細(xì)胞生長因子的調(diào)控機(jī)制

細(xì)胞生長因子主要通過旁分泌(如KGF)、自分泌(如 TGF-β)、或自分泌和旁分泌兩種形式(如EGF、FGF、PDGF)作用于角膜組織,調(diào)控細(xì)胞的增殖、移行、分化和凋亡。細(xì)胞因子首先作用于細(xì)胞表面相應(yīng)的受體,并將調(diào)控信號傳遞至細(xì)胞內(nèi),引起一系列級聯(lián)反應(yīng)。

作用于角膜細(xì)胞的細(xì)胞生長因子多經(jīng)過相似的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響其下游產(chǎn)物的表達(dá),現(xiàn)以EGF為例加以說明。EGF與其相應(yīng)細(xì)胞膜受體結(jié)合,導(dǎo)致受體的二聚化,使其胞內(nèi)酪氨酸激酶域磷酸化,通過G蛋白激活磷脂酶C(phospholipase C,PLC)?；罨腜LC水解磷脂酰肌醇二磷酸(phosphatidylinositol-4,5-biphosphate,PIP2),產(chǎn)生兩種活性的第二信使物質(zhì),即二酰基甘油(diacylglycerol,DAG)和肌醇 1,4,5-三磷酸(inositol-1,4,5-triphosphate,IP3)。IP3和DAG均可促使蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)的活化。IP3還可引起細(xì)胞內(nèi)貯存鈣的釋放,通過活化鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶促使PKC的激活?；罨腜KC導(dǎo)致絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號級聯(lián)反應(yīng),最終引起細(xì)胞增殖、遷移、分化和凋亡[2]。EGF受體的酪氨酸磷酸化后的第二條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是其與銜接蛋白Src同源域結(jié)合,導(dǎo)致Ras(一種G結(jié)合蛋白)活化,繼而激活絲裂原激活蛋白激酶信號級聯(lián)反應(yīng),其中Raf為此級聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)中的第一個蛋白激酶,即 MAPKKK(MAPK kinase kinase)[14]?；罨腅GF受體還有另一信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,即其激活胞漿型磷脂酶A2(cytosolic phospholipase A2,cPLA2),促使花生四烯酸從細(xì)胞膜磷脂中釋放,以增加前列腺素 E2(prostaglandin E2,PGE2)的合成。前列腺素水平的增加,促使腺苷酸環(huán)化酶的活化,增加cAMP水平和蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)的活性。PKA對Raf起負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用[2]。

細(xì)胞生長因子對細(xì)胞的調(diào)控作用還受ECM的影響。ECM與細(xì)胞生長因子結(jié)合導(dǎo)致其對細(xì)胞生長因子的隔絕或有控制的釋放,以調(diào)節(jié)或增強(qiáng)他們的效果[26]。

4 結(jié)語

在角膜損傷的修復(fù)中bFGF、EGF和TGF-β起著主要的調(diào)節(jié)作用,KGF、PDGF和NGF也起著一定的調(diào)節(jié)作用,這些細(xì)胞因子通過旁分泌和自分泌作用于角膜細(xì)胞的相應(yīng)受體,調(diào)節(jié)角膜細(xì)胞的生長、遷移、分化和凋亡?，F(xiàn)有的研究結(jié)果顯示這些細(xì)胞生長因子在小動物角膜損傷的修復(fù)中有良好的應(yīng)用前景。

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Roles of Cell Growth Factors in the Repair of Corneal Wound in Small Animals

DING Yi,WANG Qiong,CHEN Jian-guo,CHENG Li-li,WU Yi-qiang,XIONG Cheng,ZHOU Min-yan,WEI Jia

(College of Veterinary Medicine,Huazhong Agricultural University,Wuhan,Hubei,430070,China)

Corneal injuries of small animals(especially dogs and cats)are commonly seen in veterinary clinic.The inadequate treatment or delay of the corneal wound healing would result in sight barrier,even blindness.Studies show that cell grow th factors,such as fibroblast growth factor,epidermal growth factor,transferring growth factor-β,keratinocyte grow th factor,platelet-derived growth factor and nerve grow th factor,play important regulating roles in the repair of corneal wound.These autocrine or paracrine cytokines act on their responding receptors,influence on the downstream product expression,and elicit the control of growth,migration,differentiation and apoptosis of corneal cells through various signaling transduction pathways.Discrepancy in the distribution,quantity and time-acting sequence of cell growth factors and their responding receptors involves in the effective repair of corneal wounds.In vitroandin vivoexperiments indicate that cell growth factors have good perspective in small clinic practice.

cell growth factor;repair of corneal wound;dog;cat

S857.144

A

1007-5038(2010)08-0088-05

2009-12-13

丁一(1988-),男,湖北武漢人,主要從事動物分子生物學(xué)研究。*通訊作者