基因芯片技術(shù)在豬病毒性疾病診斷中的應(yīng)用*

葉 芬,蔡家利

(1.西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,重慶400715;2.重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院,重慶400050)

混合感染已經(jīng)成為豬群發(fā)病的普遍現(xiàn)象,使病情更為復(fù)雜,增加了臨床和實(shí)驗(yàn)室診斷難度,因此,對(duì)多種疫病同時(shí)做出診斷,及早制定和采取相應(yīng)防制措施是現(xiàn)代動(dòng)物疫病檢疫新的發(fā)展方向?；蛐酒诓≡w檢測(cè)方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),它以高通量并行檢測(cè)的方式,可以使病料中的多種病原體同時(shí)被檢出,具有快速、高效、靈敏的特點(diǎn),尤其適宜于大規(guī)模的樣本檢測(cè)。它為生物學(xué)研究提供了高通量的技術(shù)手段,已在病原體基因分型、基因表達(dá)譜分析、藥物篩選等各個(gè)領(lǐng)域顯示出廣闊的應(yīng)用前景,對(duì)于病毒性病原體的檢測(cè),已有較多報(bào)道[1-3]。但多數(shù)研究集中于單病毒的基因分型或少數(shù)病毒的低密度基因芯片檢測(cè)[4],在豬的重大病毒性疾病方面的應(yīng)用也是如此。

1 基因芯片概述

1.1 基因芯片及其原理

基因芯片的概念來(lái)源于計(jì)算機(jī)芯片,又稱為DNA芯片、DNA微陣列。它是由大量已知序列的DNA或者寡核苷酸探針密集排列所形成的探針陣列?；蛐酒幕竟ぷ髟硎墙?jīng)過(guò)標(biāo)記的待測(cè)樣本DNA通過(guò)與芯片上特定位置的探針雜交,可根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)的原理確定靶DNA序列[5]。經(jīng)過(guò)分析處理芯片的雜交檢測(cè)圖像,可以對(duì)細(xì)胞和組織中大量的基因信息進(jìn)行分析?；蛐酒軌?qū)崿F(xiàn)生物信息的大規(guī)模檢測(cè)分析,是一種進(jìn)行DNA序列分析及基因表達(dá)信息分析的強(qiáng)有力工具[6]?；蛐酒芍С治?、連接層和DNA分子探針陣列3部分組成,該項(xiàng)技術(shù)主要包括DNA方陣的構(gòu)建、樣品的制備和標(biāo)記、分子雜交和雜交圖譜的檢測(cè)分析。

1.2 基因芯片技術(shù)的分類

基因芯片技術(shù)的分類方法很多,最常用的是按載體上所點(diǎn)探針的類型分為2種[7]:①cDNA芯片,由Schena建立,是將特定的cDNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后借助機(jī)械手直接點(diǎn)到基片上;②寡核苷酸芯片,由Fodo首先報(bào)道,用照相平板印刷術(shù)和固相合成技術(shù)在基片上生成寡核苷酸,分為長(zhǎng)寡核苷酸芯片和短寡核苷酸芯片。目前,關(guān)于不同基因芯片技術(shù)的靈敏度和特異性仍存在爭(zhēng)議。起初,人們認(rèn)為長(zhǎng)寡核苷酸芯片和cDNA芯片有更高的特異性和靈敏度,現(xiàn)在看來(lái),短寡核苷酸芯片同樣有很高的特異性,因?yàn)槊恳粋€(gè)基因代表11個(gè)～20個(gè)寡核苷酸[8]。

2 基因芯片在豬重大病毒性疾病檢測(cè)中的應(yīng)用

目前,我國(guó)豬重大傳染病流行的主要特點(diǎn)是多病原混合感染,繁殖障礙性傳染病普遍存在,呼吸道傳染病日益突出,給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[9]。目前對(duì)病毒性傳染病的診斷多采用病原分離及常規(guī)的血清學(xué)方法進(jìn)行,但病原分離不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力,而且敏感性和特異性都較差,血清學(xué)診斷方法也因?qū)嶒?yàn)室條件和診斷方法的不同而產(chǎn)生不同的差異。雖然已有PCR診斷方法應(yīng)用于病毒檢測(cè),但需分別進(jìn)行診斷。而近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的基因芯片技術(shù)具有高通量和并行化的特點(diǎn),可以對(duì)成百上千甚至上萬(wàn)個(gè)基因進(jìn)行同時(shí)、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè),從而很好地解決了這一問(wèn)題[10]?；蛐酒夹g(shù)在豬重大病毒性疾病中的應(yīng)用主要有以下幾個(gè)方面。

2.1 病毒性疾病檢測(cè)的低密度基因芯片

迄今,基因芯片檢測(cè)的敏感性仍不是很高。因此,用基因芯片技術(shù)檢測(cè)病毒性病原體前,須對(duì)病原體靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增。由于同一屬內(nèi)不同病毒或同一類病毒之間的基因組結(jié)構(gòu)相似,通過(guò)序列比對(duì),容易找到同源性高的序列,在該區(qū)域設(shè)計(jì)PCR引物,可以用盡量少的引物對(duì)擴(kuò)增盡量多的病毒。而且特異PCR擴(kuò)增能有效避免細(xì)胞成分對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾,提高基因芯片檢測(cè)的特異性。因此,在豬的幾種重大病毒性疾病的研究中利用低密度基因芯片進(jìn)行病毒性病原體檢測(cè)的研究較多。

姜永厚等[11]建立的豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)基因芯片檢測(cè)方法,結(jié)合了PCR的高靈敏度和核酸雜交高特異性優(yōu)點(diǎn),可根據(jù)需要在芯片上分區(qū)點(diǎn)制多個(gè)相同的CSFV陣列以同時(shí)特異靈敏地檢測(cè)多個(gè)CSFV樣本,利用該方法對(duì)87個(gè)臨床樣品進(jìn)行了檢測(cè)鑒定,結(jié)果分析顯示,可準(zhǔn)確鑒別CSFV,靈敏度與瓊脂糖凝膠檢測(cè)接近,可檢測(cè)到的質(zhì)粒最低濃度為0.4 pg/μ L。曹三杰等[12]采用PCR擴(kuò)增制備豬傳染性胃腸炎病毒(T ransmissible gastroenteritis virus,TGEV)的靶基因并進(jìn)行純化,對(duì)基因芯片的最佳靶基因點(diǎn)樣質(zhì)量濃度、探針質(zhì)量濃度、雜交溫度、雜交時(shí)間進(jìn)行篩選,選擇構(gòu)建檢測(cè)芯片的最適靶基因,進(jìn)行基因芯片探針最佳標(biāo)記方法試驗(yàn),從而從各個(gè)方面優(yōu)化了該疾病的基因芯片診斷方法。高淑霞等[13]分別將豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、豬偽狂犬病病毒(Pseudo rabies virus,PRV)、豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus,PPV)、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV-2)、日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)和CSFV各一段保守序列制備成探針集成到一張芯片上,制備成低密度檢測(cè)基因芯片,可以同時(shí)檢測(cè)到樣品中的6種病毒及病毒核酸的存在情況。張煥容等[14]在前人研究基礎(chǔ)之上,制備了PRV、PPV和JEV 3種引起豬繁殖障礙的病毒性傳染病檢測(cè)基因芯片并進(jìn)行了該基因芯片的檢測(cè)方法研究,結(jié)果表明PRV-PPV-JEV檢測(cè)基因芯片具有良好的特異性,且該檢測(cè)系統(tǒng)的靈敏度高達(dá)3 pg/μ L。高金拽等[15]將PPV、PCV-2、CSFV分別應(yīng)用生物信息學(xué)方法,針對(duì)病毒基因組保守序列設(shè)計(jì)特異性強(qiáng)的60mer寡核苷酸探針,并將其按所設(shè)計(jì)陣列固定于表面經(jīng)氨基化修飾的玻片上,制備出寡核苷酸芯片用于臨床診斷,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,幾種病毒基因的檢測(cè)探針都能特異性地與相應(yīng)樣品雜交,能檢測(cè)到較強(qiáng)的陽(yáng)性熒光信號(hào),而空白對(duì)照和陰性對(duì)照基本不能檢測(cè)到熒光信號(hào)。Baner M K等[16]報(bào)道了區(qū)別由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)、豬水皰病病毒和水皰性口炎病毒引起的豬在臨床上的相同癥狀的鑒別基因芯片,對(duì)代表3個(gè)不同病毒的不同來(lái)源的39個(gè)cDNA樣品進(jìn)行了分析,取得了與PCR鑒定方法完全一致的結(jié)果。通過(guò)利用基因芯片,為大批量快速診斷、普查豬病毒性疫病提供了保證。

2.2 基因分型中基因芯片的應(yīng)用

豬病毒存在多樣性,不同的病毒型別有著不同的疾病譜、流行特點(diǎn)、地理分布及與其宿主特定的共進(jìn)化關(guān)系等,常見的如FMDV、SIV、PRRSV等。因此,病毒進(jìn)一步分型對(duì)指導(dǎo)防治實(shí)踐有著極為重要的意義。目前,用于病毒基因分型的方法除了型和亞型特異性PCR之外[17],還有寡核苷酸指紋圖譜技術(shù)、核酸序列分析法、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法、限制性核酸內(nèi)切酶分析、異源雙鏈泳動(dòng)法、單鏈構(gòu)象多態(tài)性、基因組片段長(zhǎng)度多態(tài)性、核酸雜交法、基因芯片法等。其中基因分型芯片具有靈敏度高,且雜交洗滌后直接掃描,操作簡(jiǎn)便等突出優(yōu)點(diǎn)[18]。

Liu Y C等[19]設(shè)計(jì)的檢測(cè)PRRSV和FMDV的基因芯片模型。以O(shè)型FMDV的VP1結(jié)構(gòu)基因作為一個(gè)長(zhǎng)信號(hào)序列,鑒定了23個(gè)不同F(xiàn)MDV株為代表的所有7個(gè)血清型。Baner J等[20]設(shè)計(jì)的一種微陣列芯片,使用的口蹄疫DNA芯片是從正常病毒和特異的血清型基因組VP1-VP3-2A獲得的,檢測(cè)了23個(gè)不同的FMDV株代表所有7個(gè)血清型并對(duì)其進(jìn)行分型,建立了在單一芯片上進(jìn)行口蹄疫鑒定和分型的基因芯片技術(shù)。

姜永厚等[21]應(yīng)用寡聚核苷酸基因雜交技術(shù)建立了一種快速可靠的檢測(cè)PCV基因型的方法。他們?cè)赑CV保守序列復(fù)制酶基因內(nèi)設(shè)計(jì)了2對(duì)特異性引物,在此物之間設(shè)計(jì)了2種基因型特異的核苷酸探針(22 mer～30 mer)。通過(guò)PCR擴(kuò)增Cy5標(biāo)記的DNA片段與固定在玻片表面的探針雜交進(jìn)行PCV基因分型。該技術(shù)很好的結(jié)合了PCR方法的高度敏感性和DNA-DNA雜交技術(shù)的選擇特異性,其檢測(cè)的結(jié)果與Calsamiglia M等[22]相一致。陳紅軍等人根據(jù)流感病毒的HA和NA基因序列間的差異性,采用基因芯片技術(shù),借助多重PCR和核酸標(biāo)記技術(shù),構(gòu)建了SIV亞型分型基因芯片,用于SIV亞型的分型,具有檢測(cè)A型流感病毒和同步鑒別豬流感病毒H1、H3、H9、N1和N2亞型的功能。研究表明,基因芯片用于病毒的基因分型有很多潛在的優(yōu)勢(shì),還有待于進(jìn)一步的發(fā)展。

2.3 表達(dá)譜分析中基因芯片的應(yīng)用

在表達(dá)譜分析中,對(duì)來(lái)源于不同個(gè)體、不同組織、不同細(xì)胞周期、不同發(fā)育階段、不同分化階段、不同病變、不同刺激下的細(xì)胞內(nèi)的mRNA或逆轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生的cDNA與芯片上的基因片段進(jìn)行雜交,可以對(duì)這些基因表達(dá)的個(gè)體特異性、組織特異性、發(fā)育階段特異性、分化階段特異性、病變特異性、刺激特異性進(jìn)行綜合的分析和判斷,從而將某個(gè)或幾個(gè)基因與疾病聯(lián)系起來(lái),確立相關(guān)基因功能以及基因與基因間的相互作用關(guān)系[23]。目前表達(dá)譜基因芯片在獸醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中已逐步得到應(yīng)用,并呈現(xiàn)出了其強(qiáng)大的功效,通過(guò)檢測(cè)基因表達(dá)水平差異,為闡明不同狀況下的基因功能,推斷基因與基因的相互關(guān)系,揭示基因與疾病的內(nèi)在聯(lián)系并發(fā)現(xiàn)可能的診斷及藥物作用靶基因等方面提供了有力的工具。

袁建琴等[24]已經(jīng)通過(guò)同種組織RNA自身比較試驗(yàn)及不同組織RNA的差異分析試驗(yàn)對(duì)CSFV cDNA芯片實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性進(jìn)行檢驗(yàn),并對(duì)cDNA芯片數(shù)據(jù)的可靠程度,對(duì)cDNA芯片試驗(yàn)數(shù)據(jù)作了整體的評(píng)估。結(jié)果證實(shí),該芯片系統(tǒng)得到的CSFV cDNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)相關(guān)系數(shù)一般大于0.9,假陽(yáng)性率控制在2%以內(nèi),具有很大的臨床參考價(jià)值。

3 存在的問(wèn)題及應(yīng)用前景

基因芯片技術(shù)作為一項(xiàng)新誕生的技術(shù),它也同樣有許多問(wèn)題需要解決。有學(xué)者指出基因芯片技術(shù)作為一種預(yù)測(cè)手段還不穩(wěn)定,應(yīng)慎重選擇[25]。首先該技術(shù)需要大量的已測(cè)知的、準(zhǔn)確的DNA、cDNA片段的信息,充分利用這些信息才能使芯片技術(shù)成為大規(guī)模、集成化、整體獲取生物信息的有效手段,現(xiàn)在尚缺乏公開可得的、經(jīng)證實(shí)準(zhǔn)確的基因序列。其次是目前研究芯片技術(shù)的費(fèi)用還比較高昂,盡管芯片或微陣列可以重復(fù)多次使用,但每次雜交反應(yīng)后,其敏感性都要降低。此外,樣品制備和標(biāo)記還比較復(fù)雜,各研究機(jī)構(gòu)中仍沒(méi)有一個(gè)統(tǒng)一的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn),各實(shí)驗(yàn)室不能分享數(shù)據(jù)和資料庫(kù)等。這些問(wèn)題已開始為許多研究者所關(guān)注。

基因芯片技術(shù)作為一種先進(jìn)的、大規(guī)模、高通量檢測(cè)技術(shù),成為疾病診斷的尖端核心技術(shù)之一。其優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在:①高度的靈敏性和準(zhǔn)確性;②快速簡(jiǎn)便;③可同時(shí)檢測(cè)多種病原。然而,傳統(tǒng)的芯片平臺(tái)因基于熒光標(biāo)記技術(shù),應(yīng)用時(shí)需要昂貴的掃描設(shè)備以及操作復(fù)雜[26],技術(shù)要求高,在獸醫(yī)臨床應(yīng)用中一直難以推廣普及。隨著功能基因組學(xué)和蛋白組學(xué)研究的深入和芯片技術(shù)的完善,一種易于在基層醫(yī)療單位推廣使用,能夠有效地解決傳統(tǒng)基因芯片在應(yīng)用過(guò)程中,需要大型檢測(cè)設(shè)備、不便于推廣的瓶頸問(wèn)題的既經(jīng)濟(jì)又可靠的新型基因芯片技術(shù)必將誕生,這一新的技術(shù)革命一定會(huì)在生命科學(xué)和相關(guān)領(lǐng)域發(fā)揮巨大的作用。

[1] Honma S,Chizhikov V,Santos N,et al.Development and validation of DNA microarray for genotyping group A rotavirus-VP4(P[4],P[6],P[8],P[9]andP[14])andVP7(G1to G6,G8 to G10 and G12)genes[J].J Clin Microbiol,2007,45(8):2641-2645.

[2] Quan P L,Palaciosv G,Jabado O J.Detection of respiratory viruses and subtype identification of influenza A viruses by Greene Chip Resp Oligonucleotide microarray[J].J Clin Microbiol,2007,45(8):2359-2362.

[3] Albrecht V,Chevallier A,M agnonec V,et al.Easy and fast detection and genotyping of high-risk human papillomavirus by dedicated DNA microarray s[J].J Virol Methods,2006,137(2):236-238.

[4] 李永強(qiáng),康曉平,王偉周,等,人獸共患病病毒基因芯片檢測(cè)敏感性的測(cè)定[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2009,34(2):219-222.

[5] Bryant P A,Venter D,Robins-Browne R,et al.DNA chip[J].Lancet Infect Dis,2004,4(2):100-111.

[6] T sukahara T,T oshifumi T,Nagasawa N,et al.Powerful tools for genetic analysis come of age[J].Sci Technol Adv Material,2004,5(3):359-362.

[7] 王寶琴,魏戰(zhàn)勇.生物芯片及其在疾病診斷中的應(yīng)用[J].中國(guó)獸醫(yī)科技,2003,33(5):33-35.

[8] Ghadimi B M,G rade M,Diflippantonio M J,et al.Effectiveness of gene expression profiling for response prediction of rectal adenocarcinomas to preoperative chemoradiotherapy[J].J Clin Oncol,2005,23(9):1826-1838.

[9] 楊宗照,方維煥.豬瘟合并豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)和豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)感染[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2006,26(3):240-242.

[10] Chou C C,Lee T T,Chen C H,et al.Design of microarray probes for virus identification and detection of emerging viruses at the genus level[J].BM C Bioinformatics,2006(7):232-236.

[11] 姜永厚,商晗武,徐 輝,等.豬瘟病毒基因芯片檢測(cè)技術(shù)的建立及應(yīng)[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2009,21(2):85-90.

[12] 曹三杰,黃小波,文心田,等.豬傳染性胃腸炎病毒檢測(cè)基因芯片的構(gòu)建[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2009,29(2):121-125.

[13] 高淑霞,吳時(shí)友,莊文忠,等.豬病毒性繁殖障礙病低密度基因芯片診斷方法的建立[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2006,15(4):39-42.

[14] 張煥容,曹三杰,文心田,等,豬偽狂犬病、豬細(xì)小病毒病和豬流行性乙型腦炎檢測(cè)病毒基因芯片的制備及檢測(cè)方法研究[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2007,29(4):796-801.

[15] 高金拽,王小強(qiáng),祁會(huì)彩,等.豬3種重要病毒寡核苷酸芯片診斷方法的建立[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2008,28(9):1000-1003.

[16] BaxiMK,Baxi S,CavijoA,et al.Micmarray-based detectionand typing of foot-and-mortth disease virus[J].Vet J,2006,172(3):73-81.

[17] 楊 振.病毒基因檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志,2006,19(1):99-101.

[18] 李永強(qiáng).病毒基因分型技術(shù)及其應(yīng)用[J].微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展,2008,36(3):56-61.

[19] Lju Y C,Huang G S,Wu M C,et al.Detection of foot and mouth disease and porcine reproductive an d respiratory syndrome viral genes using microarray chip[J].Vet Res Commun,2006,30(2):191-204.

[20] Baner J,Gyarmati P,Yaeoub A,et al.Microarray-based molecular detection of foot-and-mouth disease,vesicular stomatitis and swine vesicular disease viruses,using padlock probes[J].J Viral Methods,2007,143(2):200-206.

[21] 姜永厚,商晗武,陳偉杰,等.豬圓環(huán)病毒檢測(cè)與分型寡核苷酸芯片的建立及應(yīng)[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2008,28(10):1174-1180.

[22] Calsamig lia M,Segales J,Quintana J,et al.Detection of porcine circovirus types 1 in serum and tissue samples of pigs with and without postweaning multisy stemic wasting syndrome[J].J Clin Microbiol,2002,40:1848-1850.

[23] Xiang C C,Chen Y.cDNA microarray technology and its applications[J].Biotechnol Adv,2000,18(1):35-46.

[24] 袁建琴,高斌戰(zhàn),梁新華.豬瘟病毒基因表達(dá)譜芯片的可靠性研究[J].激光生物學(xué)報(bào),2008,17(5):613-619.

[25] Michiel S S,Koscielny S,Hill C.Prediction of cancer outcome with microarrays:a multiple random validation strategy[J].Lancet,2005,365(9458):488-492.

[26] K ricka L J.Nucleic acid detection technologies labels,strategies,and formats[J].Clin Chem,1999,45:453-458.