抗磷脂抗體導(dǎo)致妊娠丟失動物模型研究進展

朱 姝綜述，陸啟濱審校

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)2008級中醫(yī)婦科，江蘇 南京 210029;2.江蘇省中醫(yī)院婦科，南京 210029)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent sponlaneous abortion，RSA)是臨床上常見的疾病之一，其病因除與遺傳、解剖、內(nèi)分泌、感染有關(guān)外，相當(dāng)比例的RSA與抗磷脂抗體(antiphospholipin antibodies，aPL)有關(guān)，是抗磷脂綜合征(antiphospholipid syndrome，APS)主要的臨床表現(xiàn)之一。aPL導(dǎo)致流產(chǎn)的病因多認(rèn)為與血栓形成有關(guān)，但具體機制不明，為了更好地研究aPL與妊娠丟失的關(guān)系，建立其動物模型顯得尤為重要，aPL導(dǎo)致妊娠丟失的動物模型方法不一，且用來誘導(dǎo)aPL產(chǎn)生的抗體或抗原的種類各異，現(xiàn)將近年來國內(nèi)外對aPL導(dǎo)致妊娠丟失動物模型研究的概況綜述如下。

1 采用自身免疫性疾病的動物模型

具有系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，S LE)傾向的小鼠逐漸出現(xiàn)類似于SLE患者的臨床表現(xiàn)，可伴有血栓形成，aPL濃度升高等表現(xiàn)，現(xiàn)被人們所認(rèn)知的主要有兩種小鼠類型，即 MRL/lpr鼠和(NZW×BXSB)F 1鼠[1]。Gharavi等[2]研究發(fā)現(xiàn)M RL/lpr雌鼠在2月齡時可呈現(xiàn)出抗心磷脂抗體(anticardiolipid antibodies，aCL)的活性，雄鼠是在3月齡時可呈現(xiàn)出aCL活性，且這類鼠表現(xiàn)出aCL的活性不依賴于作為輔因子參與的β2-糖蛋白 I(β2-glycoprotein I，β2-GPI)，但是這類自身免疫性小鼠多用來研究SLE的發(fā)病機制，而單獨作為妊娠丟失模型的研究較少。

2 采用被動誘導(dǎo)法造模

此種方法多通過給不同種類的孕鼠注射單克隆或多克隆的aPL，或注射β2-GPI來誘導(dǎo)模型產(chǎn)生，觀察 aPL對妊娠丟失的直接作用。

2.1 用單克隆或多克隆的a PL來造模

2.1.1 用單克隆或多克隆的aCL-Ig G或aCL-Ig M來誘導(dǎo)模型產(chǎn)生 Blank等[3]用ICR小鼠來造模，待小鼠受孕后通過尾靜脈注射單克隆的aCL-IgG或多克隆的aCL-IgG/Ig M，結(jié)果出現(xiàn)很低的胚胎成活率以及胎鼠宮內(nèi)發(fā)育遲緩。Fishman等[4]同樣用ICR小鼠造模，在ICR雌鼠妊娠第1天時通過尾靜脈注射10μg的aC L單克隆抗體，妊娠第15天時處死孕鼠，發(fā)現(xiàn)胚胎吸收率在32%左右。Ikematsu等[5]用單克隆的aCLIgG注入BALB/c孕鼠體內(nèi)，結(jié)果出現(xiàn)了胚胎吸收，胎鼠體質(zhì)量及胎盤質(zhì)量顯著下降，而且胎盤中有aCL-Ig G沉積，胎盤病理組織切片顯示栓塞及壞死。Sthoeger等[6]在胚胎植入前給BALB/c孕鼠注射鼠單克隆aC L-Ig M后，出現(xiàn)了不良的妊娠結(jié)局。而在植入后注射單克隆aCL-IgM則不影響妊娠結(jié)果，提示aCL-IgM主要是通過干擾胚胎植入而影響妊娠結(jié)局的。

2.1.2 從APS患者的血清中提取抗體來造模 衛(wèi)愛武等[7]通過收集aCL陽性(定量檢測為中、高度)RS A或具有胚胎停育病史患者的血清及狼瘡抗凝物(lupus anticoagulant，LA)陽性患者的血清，經(jīng)二次鹽析法蛋白液提純后，在SD大鼠孕第8、12天時通過背部多部位皮下注射aCL純化蛋白液、LA純化蛋白液，動物于孕第 15天處死，結(jié)果產(chǎn)生了高濃度的aCL，胚胎吸收率增加，胚胎質(zhì)量明顯減輕等表現(xiàn)。

Holers等[8]通過收集APS患者(臨床表現(xiàn)為 RSA、SLE、網(wǎng)狀青斑等，且含有高濃度aPL-IgG，aPL-IgG＞145 GPL U)的血清，利用親和層析法分離aPL-IgG，在BA LB/c孕鼠妊娠第8、12天腹腔注射10 mg的aPL-IgG，在妊娠第 15天處死孕鼠，結(jié)果出現(xiàn)了胚胎吸收率增加，胚胎體質(zhì)量下降，胎盤組織病理切片顯示炎性細胞浸潤，母胎界面補體C3及aPL沉積。Berman等[9]用同樣的方法造模，發(fā)現(xiàn)與未受孕的BALB/c小鼠相比，注射aPL-IgG的孕鼠外周血中aPL的水平明顯降低，并且循環(huán)中的TNF-α升高，而蛻膜中顯示有大量的aPL沉積，未受孕的BALB/c小鼠子宮內(nèi)膜中卻無aPL沉積，循環(huán)中的TNF-α也未升高，未受孕與受孕小鼠的心、肝、腎、肺中都沒有aPL沉積，提示aPL能特異地與蛻膜組織中的的磷脂結(jié)合，引起母胎界面上一些促炎因子釋放，補體激活，組織損傷，最終導(dǎo)致胚胎丟失。

2.1.3 用抗纖維蛋白溶酶抗體來造模 Chen等[10]用多克隆的抗纖維蛋白溶酶抗體(anti-plasmin Ab)注入BALB/c孕鼠體內(nèi)來誘導(dǎo)模型產(chǎn)生，在BALB/c孕鼠妊娠第8天及第12天時通過腹腔注射500μg的 anti-plasmin Ab，在妊娠第15天時處死孕鼠，與對照組相比，模型組出現(xiàn)了明顯的胚胎吸收，胎盤病理組織切片有大量的C3b/C3c及aCL沉積。

2.1.4 用抗β2-GPI抗體來造模 Blank等[11]用抗β2-GPI抗體，在BALB/c雌鼠與雄鼠交配后形成陰栓時通過尾靜脈注射20 mg/200 m L的抗β2-GPI抗體，在孕鼠妊娠第16天時處死，出現(xiàn)了妊娠丟失。

2.1.5 用抗磷脂酰絲氨酸抗體來造模 還有人用其他的APA來造模，例如將抗磷脂酰絲氨酸抗體(anti-phosphatidylserine anti-bodies，aPS)分別注入BALB/c、CD-1和ICR孕鼠體內(nèi)，也出現(xiàn)了妊娠丟失[12-13]。

2.2 用β2-GPI來造模 β2-GPI又稱載脂蛋白 H，由肝細胞合成，是相對分子質(zhì)量為50 KD的單鏈糖蛋白。研究發(fā)現(xiàn)β2-GPI對于小鼠體內(nèi)的磷脂(C L)具有高親和性，注入小鼠體內(nèi)可使弱免疫原性的CL轉(zhuǎn)變?yōu)槊庖咴?，并誘導(dǎo)aPL產(chǎn)生[14]。Blank等[15]在BALB/c小鼠交配后形成陰栓時通過尾靜脈注射入純化的β2-GPI(從健康人的血清中提取)，在妊娠第16天時處死孕鼠，結(jié)果孕鼠產(chǎn)生了高水平的aC L，出現(xiàn)了妊娠丟失，并且出現(xiàn)部分凝血酶原時間延長，血小板減少癥及胚胎吸收率增加等一系列表現(xiàn)。

3 采用主動免疫法造模

這種方法通過用抗體或抗原主動免疫正常未受孕的小鼠，誘導(dǎo)小鼠發(fā)生免疫反應(yīng)后，再與雄鼠交配，從而導(dǎo)致妊娠丟失模型的產(chǎn)生。

3.1 用抗體作為免疫物質(zhì)進行造模 利用產(chǎn)生病理性獨特性抗體的原理來免疫動物，即先給動物注射抗體-Ab1，使之產(chǎn)生抗Ab1抗體-Ab2，然后產(chǎn)生抗 Ab2抗體-Ab3，而Ab3與 Ab1的功能特性相似，從而產(chǎn)生了免疫動物的效果。

Yodfat等[16]給未免疫過的雌鼠分別注射人IgM 和IgG類型的aPL，待雌鼠自身產(chǎn)生了aPL后，再與雄鼠交配，結(jié)果注射aPL-IgG的雌鼠產(chǎn)生了胚胎吸收，而注射aPL-Ig M的雌鼠卻沒有產(chǎn)生胚胎吸收。Cohen等[17]給BALB/C小鼠后足皮內(nèi)注射1μg的溶于弗氏佐劑的單克隆a PL-IgG(從APS患者的血清中純化獲得)，3周后，加強免疫 1次，注射溶于等壓 PBS溶液中的單克隆aPL-Ig G 1μg，4個月后免疫過的雌鼠與雄鼠交配，在妊娠第15天時處死，也出現(xiàn)了胚胎吸收。Yodfat等[18]用 APS-IgG及APS-Ig GM(從APS患者血清中提取純化所得)分別免疫BALB/C小鼠，利用病理性獨特性抗體產(chǎn)生的原理，誘導(dǎo)模型產(chǎn)生，結(jié)果只有注射aPS-IgG的小鼠產(chǎn)生了高滴度的APS、血小板減少癥及增加的胚胎吸收率。Sthoeger等[19]用鼠單克隆的aCL-IgM(2C4C2)來免疫動物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種造模方法導(dǎo)致妊娠丟失的原因主要是在胚胎植入期通過破壞胚胎的種植而導(dǎo)致妊娠的丟失。Krause等[20]給BALB/c小鼠后足皮內(nèi)注射10μg的溶于弗氏佐劑的anti-C L MoAb(H-3)，3個星期以后加強注射1次10μg的溶于 PBS的H-3，12～14周后免疫過的雌鼠與雄鼠交配，以發(fā)現(xiàn)陰栓為妊娠第1天，妊娠第 15天時處死，結(jié)果出現(xiàn)了較高的胚胎吸收率。Blank等[21]用單克隆的anti-dsDNA IgM 型抗體(MIV-7)免疫BALB/c小鼠后，小鼠產(chǎn)生了高水平的aC L-IgG及 LA，并且出現(xiàn)了血小板減少癥、較高的胚胎吸收率、胎盤質(zhì)量及胚胎體質(zhì)量下降等表現(xiàn)。

3.2 用抗原作為免疫物質(zhì)進行造模 Aron等[22]用8周齡的MRL/++小鼠造模，用20μg溶于弗氏佐劑β2-GPI免疫小鼠后，在雌鼠22周齡時與雄鼠交配，發(fā)現(xiàn)陰栓為妊娠第1天，妊娠第15天時處死孕鼠，產(chǎn)生了高水平的aCL及較高的胚胎吸收率。劉潤俠等[23]通過給昆明種小鼠皮下多部位注射加有等體積弗氏佐劑的β2-GPI(1 mg/m L)150μg，每周1次，共3次，結(jié)果與對照組相比，小鼠產(chǎn)生了高水平的aC L，但對于妊娠結(jié)局的影響尚未做進一步研究。Gharavi等[24]用合成的多肽(與β2-GPI的磷脂結(jié)合位點具有相同結(jié)構(gòu))，溶于含有牛人血清蛋白的弗氏佐劑來免疫NIH/Swiss鼠后，NIH/Swiss鼠產(chǎn)生了高水平的aPL，但至于這種多肽誘導(dǎo)產(chǎn)生的aPL能否導(dǎo)致妊娠丟失還有待于進一步研究。

4 采用骨髓移植造模

Blank等[25]先用放射線照射BALB/c小鼠，使小鼠喪失免疫功能后，然后將來源于APS實驗性小鼠的全骨髓細胞和T細胞剔除的骨髓細胞分別移植到BALB/c小鼠體內(nèi)，移植全骨髓細胞的小鼠體內(nèi)立即產(chǎn)生了高濃度的aCL及其他aPL，并出現(xiàn)了較高的胚胎吸收率，而移植T細胞剔除骨髓細胞的小鼠卻沒有上述現(xiàn)象發(fā)生，提示T細胞在aPL導(dǎo)致妊娠丟失的產(chǎn)生中起著重要的作用。雖然這種方法并不是主要用來進行aPL導(dǎo)致妊娠丟失動物模型的建立，但卻為aPL導(dǎo)致妊娠丟失的機制研究提供了一個信息，即aPL導(dǎo)致妊娠丟失產(chǎn)生的過程中，T細胞是參與的。

5 展 望

綜上所述，aPL導(dǎo)致妊娠丟失動物模型方法不一，主動免疫法通過注射一定的抗原或抗體，使動物自身產(chǎn)生抗體，但實驗周期較長，耗材較多，不利于大規(guī)模的動物實驗。S LE傾向的基因小鼠雖然能產(chǎn)生較高的aPL，并有栓塞表現(xiàn)，但這種小鼠多用來研究S LE，不適合作為研究aPL導(dǎo)致妊娠丟失的規(guī)范動物模型。骨髓移植雖然能夠產(chǎn)生較高的aCL水平及胚胎吸收率，但需要用APS實驗性小鼠的骨髓細胞，旨在說明aPL導(dǎo)致妊娠丟失中T細胞的參與，與動物模型的建立有重復(fù)之嫌。相比之下，被動誘導(dǎo)法具有實驗周期短的優(yōu)點，并且側(cè)重于研究aPL在誘導(dǎo)妊娠丟失方面的病理機制，但不能很好地模擬臨床上aPL在體內(nèi)產(chǎn)生的過程。綜合利弊，大多數(shù)學(xué)者更傾向于利用被動誘導(dǎo)法來造模，通過收集APS患者(含有高濃度aPL-Ig G)的血清，用親和層析法提取 aPL-Ig G，把提取出來的多克隆的aPL-Ig G注射到孕鼠體內(nèi)，從而導(dǎo)致妊娠丟失。這種被動誘導(dǎo)造模法在大規(guī)模動物實驗中更為可行，因為這種方法所用抗體來自于APS患者血清，而這些患者體內(nèi)異常的aPL是導(dǎo)致流產(chǎn)的主要因素，親和層析法又是目前比較常用的提取IgG的方法，與其他被動誘導(dǎo)造模法相比，具有價格低廉，模型較穩(wěn)定的優(yōu)點，便于大規(guī)模動物實驗研究。aPL導(dǎo)致妊娠丟失動物模型給我們提供了一個很好的研究aPL導(dǎo)致流產(chǎn)機制的平臺，既往的研究多偏重于栓塞方面，因為aPL在體內(nèi)及體外實驗中都證明可通過激活內(nèi)皮細胞、單核細胞，血小板導(dǎo)致高凝狀態(tài)，連續(xù)許多年，aPL導(dǎo)致的流產(chǎn)普遍認(rèn)為是栓塞的緣故，但具體病理機制還未完全闡明，有待進一步研究。最近在aPL導(dǎo)致妊娠丟失動物模型中發(fā)現(xiàn)炎癥及補體激活在aPL導(dǎo)致妊娠丟失的病理中也起著非常重要的作用[26-28]。另外在aPL導(dǎo)致妊娠丟失的動物模型中發(fā)現(xiàn)，除了出現(xiàn)妊娠丟失外，還伴有胚胎體質(zhì)量及胎盤質(zhì)量下降等改變。因此，借助于aPL導(dǎo)致妊娠丟失的動物模型，對于a PL導(dǎo)致流產(chǎn)的研究可以擴寬領(lǐng)域，包括其與胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩的關(guān)系、炎癥及補體激活在aPL導(dǎo)致妊娠丟失中的作用等，都將是今后進一步研究的方向。

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