腹膜間皮細(xì)胞的培養(yǎng)及TGF-β1 CTGF蛋白含量測定

徐慶，陸頌華（南通市第三人民醫(yī)院肛腸科，江蘇南通226006）

腹膜間皮細(xì)胞的培養(yǎng)及TGF-β1 CTGF蛋白含量測定

徐慶，陸頌華
（南通市第三人民醫(yī)院肛腸科，江蘇南通226006）

目的建立簡便有效的腹膜間皮細(xì)胞體外培養(yǎng)鑒定及TGF-β1、CTGF蛋白含量測定方法。方法胰蛋白酶-EDTANa2消化網(wǎng)膜組織培養(yǎng)腹膜間皮細(xì)胞；用形態(tài)學(xué)、免疫組化鑒定細(xì)胞。結(jié)果分離培養(yǎng)的細(xì)胞符合間皮細(xì)胞特征；ELISA法測定細(xì)胞培養(yǎng)液中TGF-β1、CTGF蛋白含量簡便可行。結(jié)論胰蛋白酶消化法是一種簡單實(shí)用的分離腹膜間皮細(xì)胞的方法；ELISA法測定細(xì)胞培養(yǎng)液中TGF-β1、CTGF蛋白含量，可能成為衡量預(yù)防術(shù)后腹腔粘連藥物療效的客觀指標(biāo)。

間皮細(xì)胞；TGF-β1；CTGF；蛋白；含量測定

近年來有關(guān)腹腔粘連的發(fā)生機(jī)理多傾向于炎癥學(xué)說［1］。認(rèn)為各種因素造成腹膜損傷，導(dǎo)致炎癥滲出，產(chǎn)生纖維蛋白粘連。事實(shí)上，任何機(jī)械損傷、腹膜炎癥、組織缺血等病理因素均可引起腹膜的損傷，使腹膜的纖維蛋白溶解酶活性降低，導(dǎo)致大量的纖維蛋白沉積于腹腔器官及腹膜壁層表面而形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，最終形成永久的纖維結(jié)締組織性粘連。纖維蛋白沉積和降解之間是否平衡是形成粘連的決定性因素［2］。正常的腹膜間皮細(xì)胞具有纖溶活性，有多種生長因子和細(xì)胞因子參與調(diào)控纖維蛋白沉積和降解之間的平衡，其中轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）β1、結(jié)締組織生長因子（CTGF）與粘連的形成關(guān)系密切。因此，建立腹膜間皮細(xì)胞體外培養(yǎng)體系及TGF-β1、CTGF蛋白含量測定方法，為研究腹膜間皮細(xì)胞生理功能及其在腹腔粘連防治中的作用提供了有效手段?，F(xiàn)階段國內(nèi)對腹膜間皮細(xì)胞TGF-β1、CTGF蛋白含量的測定，基本屬于空白。筆者綜合文獻(xiàn)方法并加以改進(jìn)，建立了簡便有效的腹膜間皮細(xì)胞體外培養(yǎng)及TGF-β1、CTGF蛋白含量方法。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 材料無菌取自南通市第三人民醫(yī)院普外科腹部手術(shù)切除的大網(wǎng)膜。

1.2 儀器設(shè)備眼科剪、鑷，培養(yǎng)皿，50 mL培養(yǎng)瓶，吸管，10 mL尖底離心管，CO2培養(yǎng)箱，超凈臺，離心機(jī)，倒置相差顯微鏡，100目不銹鋼篩，0.22μm濾膜過濾器，方盤，Labsystems Finnpipette 100μL單道移液器，Thermo 50μL 8道移液器，HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司），Thermo Multiskan Spectrum spectrophotometer酶標(biāo)儀，伯樂BD-108冰箱（－30℃）。

1.3 試劑

1.3.1 PBS液氯化鈉8.0 g，氯化鉀0.2 g，磷酸氫二鈉1.56 g，磷酸二氫鉀0.2 g溶于1 000 mL三蒸水中，過濾滅菌分裝，室溫保存。

1.3.2 1640培養(yǎng)基（Invitrogen Corporation公司產(chǎn)品）按說明配制，并使其含有青鏈霉素各100 U／mL，小

牛血清20%，過濾除菌分裝，－20℃保存。

1.3.3 細(xì)胞消化液胰蛋白酶（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）2.5 g，EDTA二鈉鹽（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）0.16 g溶于1 000mL PBS液中，過濾除菌，分裝于小瓶內(nèi)，－20℃保存。

1.3.4 免疫組化抗體波形蛋白抗體，第8因子抗體，CD45抗體，ElivisionTMplus廣譜試劑盒均為（均為福建邁新公司產(chǎn)品）。

1.3.5 Elisa測定試劑盒g(shù)oat anti rat Connective Tissue Growth Factor Elisa測定試劑盒，goat anti rat Fibronectin Elisa測定試劑盒g(shù)oatanti rat Transforming Growth Factor typeβ1 Elisa測定試劑盒（美國ADL公司）。

1.3.6 TNF-α抗體（南京生興）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 腹膜間皮細(xì)胞的培養(yǎng)將剪取的網(wǎng)膜組織（約3 cm×3 cm）置于含青、鏈霉素的無菌生理鹽水中浸泡漂洗后，平鋪于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，PBS反復(fù)漂洗，剪除血管及脂肪，將漂洗后的網(wǎng)膜組織剪碎，加入胰蛋白酶－EDTA細(xì)胞消化液20 mL，放置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)消化25min，每5 min振搖1次，最后5 min保持靜止。將消化液用100目不銹鋼篩過濾于培養(yǎng)皿內(nèi)，加入等量完全培養(yǎng)液終止消化。分裝于10 mL尖底離心管，1 000 r／min，離心10min，棄上清，加入適量完全培養(yǎng)液溶解細(xì)胞沉淀，分裝于50 mL培養(yǎng)瓶，放置于培養(yǎng)箱內(nèi)。原代細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，以等體積的新鮮完全培養(yǎng)液替換瓶內(nèi)全部陳舊培養(yǎng)液，此后每3 d換液1次。約培養(yǎng)（4～7）d細(xì)胞生長融合，可以首次傳代。當(dāng)細(xì)胞生長融合成單層，PBS漂洗2次，每瓶加入完全消化液2 mL，在培養(yǎng)箱內(nèi)消化15 min。鏡下觀察細(xì)胞消化情況，細(xì)胞脫落變形后，加入4 mL完全培養(yǎng)液終止消化。將細(xì)胞懸液分裝于離心管內(nèi)1 000 r／min，離心10 min，棄上清，加入適量完全培養(yǎng)液溶解細(xì)胞沉淀，分別傳代于50mL培養(yǎng)瓶和含蓋玻片的6孔板內(nèi)，加入適量完全培養(yǎng)液，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)至細(xì)胞完全貼壁伸展。

2.2 腹膜間皮細(xì)胞的鑒定免疫組化鑒定：細(xì)胞爬片入10%中性福爾馬林固定；入0.1%Triton×100；滴加即用型一抗，室溫下孵育60 min BPS洗3次。每張蓋玻片分別滴加50μL ElivisionTMplus廣譜試劑盒中的試劑A及試劑B；顯色，復(fù)染；脫水；封片。

2.3 ELISA法測定細(xì)胞培養(yǎng)液中TGF-β1、CTGF蛋白含量采用ELISA法測定細(xì)胞上清液中TGF-β1、CTGF蛋白含量。（試劑盒購自福建邁新公司）：直接取細(xì)胞上清50μL進(jìn)行測定。（1）測定前將試劑盒放置室溫30 min，使用前將所有試劑都輕輕搖勻；（2）濃縮洗滌液與新鮮的醫(yī)用雙蒸水1∶20倍稀釋，混勻待用；（3）取出酶標(biāo)板，加入50μL的細(xì)胞上清于空白微孔中，先后加入10μL的生物素標(biāo)記液及50μL的酶標(biāo)記溶液；（4）用保鮮膜密封酶標(biāo)板，然后置于37℃的水浴鍋中準(zhǔn)確水浴60min；（5）在每個(gè)孔中分別加入底物A 50μL底物B 50μL，用移液器反復(fù)吸打，進(jìn)行混勻；（6）輕微振搖酶標(biāo)板，然后在37℃水浴鍋中避光反應(yīng)15 min；（7）每個(gè)微孔中加入50μL的終止液，用移液器反復(fù)吸打，進(jìn)行混勻；（8）在Thermo Multiskan Spectrum spectrophotometer酶標(biāo)儀上，450 nm處測定OD。

3 結(jié)果

光鏡下剛從腹膜消化下來的間皮細(xì)胞呈分散的小圓型細(xì)胞，約24 h左右貼壁，個(gè)別細(xì)胞伸展。72 h所有貼壁細(xì)胞均伸展，呈梭形等，邊緣不整，細(xì)胞呈現(xiàn)拉網(wǎng)狀生長，與相鄰的細(xì)胞相互連接。以后細(xì)胞拉網(wǎng)生長現(xiàn)象減少，生長融合呈多角形，大小較為一致，似鋪路石樣外觀。免疫組化鑒定，光鏡下觀察所培養(yǎng)細(xì)胞的波形蛋白染色為陽性。ELISA法測定細(xì)胞培養(yǎng)液中TGF-β1、CTGF蛋白含量簡便可行。

4 討論

間皮細(xì)胞作為一種特殊的上皮細(xì)胞，由于其生長環(huán)境的特殊性，是上皮細(xì)胞中最難培養(yǎng)的細(xì)胞之一。目前國內(nèi)外培養(yǎng)間皮細(xì)胞的方法大致有以下幾種：（1）腹水、透析液中分離培養(yǎng)間皮細(xì)胞。（2）以網(wǎng)膜組織或腹膜組織為來源進(jìn)行的組織塊培養(yǎng)法。（3）以各種組織細(xì)胞消化酶如膠原酶、胰酶、EDTA或胰酶＋EDTA進(jìn)行的消化法培養(yǎng)。（4）用動(dòng)物的網(wǎng)膜或腹膜進(jìn)行培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)所建立的腹膜間皮細(xì)胞培養(yǎng)模型，方便、易行、廉價(jià)、高效、重復(fù)性高，為體外研究腹膜間皮細(xì)胞生理功能及其在腹腔粘連防治中的作用提供了有效手段。TGF-β1、CTGF等具有調(diào)節(jié)纖溶酶原激活物的活性作用從而抑制術(shù)后腹腔粘連的發(fā)生，ELISA法測定細(xì)胞培養(yǎng)液中TGF-β1、CTGF蛋白含量，可能成為衡量預(yù)防術(shù)后腹腔粘連藥物療效的客觀指標(biāo)。

R392.12

B

1007－4813（2010）05－0753－02

徐慶（1975－），男，碩士研究生。研究方向：肛腸科疾病。