雜色曲菌素HPLC檢測(cè)方法的建立及其在大米污染樣品中的運(yùn)用

譚輝勇，方明英，王衡馨，姚冬生，劉大嶺*

(暨南大學(xué)微生物技術(shù)研究所，廣東 廣州 510632)

雜色曲菌素HPLC檢測(cè)方法的建立及其在大米污染樣品中的運(yùn)用

譚輝勇，方明英，王衡馨，姚冬生，劉大嶺*

(暨南大學(xué)微生物技術(shù)研究所，廣東 廣州 510632)

采用自制雜色曲菌素(VA)標(biāo)準(zhǔn)品，建立大米中雜色曲菌素的高效液相色譜檢測(cè)方法。大米污染樣品經(jīng)丙酮提取、柱色譜凈化，HPLC-紫外檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)波長(zhǎng)288nm。結(jié)果表明，VA在100～1250ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r＞0.999，方法回收率在84.12%～105.12%之間，平均變異系數(shù)小于7.5%，最低檢測(cè)限為50ng/mL。該方法靈敏度較高、穩(wěn)定性好、成本較低，可以用于糧食中雜色曲菌素的定量檢測(cè)。

雜色曲菌素；高效液相色譜；柱色譜法；紫外檢測(cè)器

雜色曲菌素(VA，versicolorin A)又稱1,6,8-三羥基-2-羥甲基蒽醌，它是黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)及雜色曲霉素(sterigmytocystin，ST)合成代謝過(guò)程中的重要前體物，其結(jié)構(gòu)含有與AFB1和ST相同的毒性基團(tuán)——雙呋喃環(huán)[1-2](圖1)。早在20世紀(jì)80年代，Wong等[3-5]就對(duì)VA的急性毒性和致畸變性做了初步研究，其LD50(小鼠靜脈注射)為20mg/kg，致突變劑量(ames test)為800ng/皿，因而雜色曲菌素的毒性不容忽視。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)糧食和飼料中黃曲霉毒素和雜色曲霉素的危害相當(dāng)重視，發(fā)展了很多高靈敏的分析檢測(cè)方法[6-7]，但對(duì)雜色曲菌素的污染和檢測(cè)關(guān)注不足，未列為法定的檢測(cè)內(nèi)容，相應(yīng)的H P L C分析檢測(cè)方法僅見McCormick等少數(shù)的報(bào)道[8-9]，主要以TLC方法[10-12]為主，該法靈敏度不高，可靠性也不強(qiáng)。本研究通過(guò)對(duì)寄生曲霉誘變菌株的培養(yǎng)，分離純化、制備VA的標(biāo)準(zhǔn)品，建立雜色曲菌素的HPLC分析檢測(cè)方法，并對(duì)污染的大米樣品進(jìn)行檢測(cè)運(yùn)用，探索適合糧食中VA檢測(cè)的分析方法。

圖1 AFB1、ST和VA化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of AFB1, ST and VA

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

寄生曲霉突變菌ATCC 36537 ATCC公司；寄生曲霉突變菌野生菌GIM3395 中國(guó)科學(xué)院廣東微生物研究所；大米 市購(gòu)。

丙酮、石油醚、正己烷、甲醇、乙醚、二氯甲烷均為AR級(jí)，其中用于高效液相色譜儀的試劑均為色譜純。培養(yǎng)基所需成分(參照菌種說(shuō)明)購(gòu)自廣州市環(huán)出凱微生物科技有限公司；VA(純度99.99%)。

UFLC系列半制備型高效液相色譜儀(配二極管陣列檢測(cè)器) Shimadiu公司；1100系列質(zhì)譜儀 Agilent公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；arium 611超純水系統(tǒng) Sartorius公司；冷凍干燥儀 Lishin公司。

1.2 方法

1.2.1 VA標(biāo)準(zhǔn)品的制備

1.2.1.1 突變菌株的培養(yǎng)

將寄生曲霉突變菌ATCC 36537接種于MEA液體培養(yǎng)基中，24℃黑暗靜止培養(yǎng)5d，然后取適量活化后的菌株接入YES培養(yǎng)基24℃黑暗靜止培養(yǎng)約10d左右。

1.2.1.2 VA的提取

收獲培養(yǎng)好的菌絲體，100℃滅菌15min，充分搗碎，加入足量的丙酮提取，收集丙酮提取液，5 0℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，加入250mL 體積分?jǐn)?shù)50%的丙酮溶液溶解，轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，用100mL石油醚萃取3次，去掉部分雜質(zhì)，然后加入100mL正己烷萃取3次，收集正己烷層，5 0℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，溶于適量甲醇備用。

1.2.1.3 VA的純化制備

采用半制備型高效液相色譜儀進(jìn)行純化。儀器條件：柱子：Shim-pack PRC-ODS(20mm×250mm，15μm)；流動(dòng)相為甲醇-水；洗脫程序?yàn)?～30min由95%的甲醇溶液逐步變化為100%的甲醇；流速：4mL/min；進(jìn)樣量：1mL；檢測(cè)波長(zhǎng)為288nm。

1.2.1.4 VA的LC-MS鑒定

儀器條件：柱子：Zorbax SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)；保護(hù)柱：ZORBAX SB-C18(4.6mm×12.5mm，5μm)；柱溫：40℃；質(zhì)譜條件：ESI離子源；離子極性：陰性；掃描范圍：50～500u；霧化氣壓：40psi；干燥氣流速：12.0L/min；干燥氣溫度：350℃；碰撞能量：自動(dòng)MS/MS：1.0V；選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)：1.0V；目標(biāo)質(zhì)量：350u；化合物穩(wěn)定性：50%；離子阱驅(qū)動(dòng)水平：100%；掃描1：－60.8V；掃描2：－6.0V；八級(jí)桿射頻振幅：150.0Vpp；錐型體1：5.0V；錐型體2：60.0V；毛細(xì)管出口：－148.7V；毛細(xì)管出口補(bǔ)償：－87.9V；目標(biāo)：30000；自動(dòng)質(zhì)譜/質(zhì)譜閾值：10000；氮?dú)猓?9.5%；氦氣：99.9995%；MS/MS同時(shí)記錄總離子流色譜圖。

1.2.1.5 紫外特征吸收檢測(cè)及純度分析

檢測(cè)條件：柱子：SHIMADIU ODS-C18(4.6mm× 150mm，5μm)；流動(dòng)相為10mmol/L醋酸銨-20μmol/L乙酸鈉溶液(A)和10mmol/L醋酸銨-20μmol/L乙酸鈉甲醇溶液(B)，采用梯度洗脫(洗脫程序設(shè)定見表1)；流速：0.3mL/min；進(jìn)樣量10mL；二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為288nm。方法參照文獻(xiàn)[13]方法并加以改進(jìn)。

表1 紫外特征吸收檢測(cè)梯度洗脫程序Table 1 HPLC gradient elution program for VA analysis

1.2.2 大米樣品中VA的檢測(cè)

將大米在紫外燈下用無(wú)菌雙蒸水浸泡1h，然后分裝于27個(gè)預(yù)先滅好菌的培養(yǎng)皿(20g/皿)中，向其中24個(gè)培養(yǎng)皿中分別接入1mL 1×106CFU/mL的寄生曲霉突變菌野生菌GIM3395孢子懸液(用Tween-80配制)，另外3個(gè)培養(yǎng)皿做為空白對(duì)照。28℃，相對(duì)濕度80%的條件下避光靜止培養(yǎng)2 0 d，第3、5、7、1 0、1 1、1 4、

17、20天分別各取3個(gè)皿，按下述方法提取、凈化和檢測(cè)。

1.2.2.1 VA的提取

將20g大米樣品粉碎，用足量的丙酮提取，將丙酮提取液通過(guò)無(wú)水硫酸鈉過(guò)濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，加入50mL體積分?jǐn)?shù)50%的丙酮溶液溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中；50mL石油醚萃取3次，丟棄石油醚層；在剩下的丙酮溶液層中，加入50mL正己烷萃取3次，收集正己烷層；將收集好的正己烷層于－20℃冰箱中過(guò)夜，過(guò)濾[14](可除去少量油脂)，蒸干后溶于4mL甲醇，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 VA的凈化

采用硅膠吸附柱進(jìn)行樣品凈化。分別稱量5g(200～300目)硅膠、1g(100～200目)硅膠、4g無(wú)水硫酸鈉110℃活化2h，冷卻至70℃左右后于干燥器中保存?zhèn)溆谩Ｔ?5mm×300mm的層析柱中先加入石油醚10mL，然后加入2g無(wú)水硫酸鈉，用玻棒輕輕攪動(dòng)，排出無(wú)水硫酸鈉層內(nèi)的氣泡。然后在裝有5g(200～300目)硅膠吸附劑的燒杯中加入15mL石油醚，用玻棒輕輕攪動(dòng)，使硅膠懸浮，同時(shí)打開層析柱下口活塞，使柱內(nèi)石油醚緩慢流出，將懸浮的硅膠吸附劑移入柱中。當(dāng)硅膠吸附劑自然下沉，石油醚液面下降至硅膠吸附劑上方3～4cm時(shí)，關(guān)閉活塞，加入吸附有待凈化樣品的100～200目硅膠1g (干法上樣)，再加入無(wú)水硫酸鈉2g，然后依次按照下列溶劑洗脫：石油醚10mL，乙醚-正己烷(4:6，V/V)10mL，二氯甲烷-丙酮(9:1，V/V)20mL，收集第3步洗脫劑，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，溶于1 mL甲醇，待測(cè)。

1.2.2.3 VA的檢測(cè)

檢測(cè)條件同標(biāo)品制備中的純度分析。

1.2.2.4 方法的回收率、精密度、線性范圍和檢出限

向未檢出VA的大米空白樣品中加入雜色曲菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定回收率；重復(fù)9次計(jì)算精密度[15]；通過(guò)測(cè)定不同質(zhì)量濃度的雜色曲菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 0 0、2 0 0、500、750、1000、1250ng/mL)確定線性范圍；信噪比按RSN＞3計(jì)[16]，可得雜色曲菌素的檢出限。

2 結(jié)果與分析

2.1 VA標(biāo)準(zhǔn)品的制備與純化

圖2 VA標(biāo)準(zhǔn)品的制備分離圖譜Fig.2 Semi-preparative HPLC chromatogram for VA purification

通過(guò)半制備高效液相色譜對(duì)粗樣品進(jìn)行分離(圖2)，收集保留時(shí)間為30.551min的目的峰，不斷重復(fù)累積，最后冷凍干燥，采用精度為0.001mg的電子天平稱量，獲得了大約0.6mg VA標(biāo)準(zhǔn)品。

2.2 LC-MS鑒定

圖3 VA標(biāo)準(zhǔn)品的一級(jí)離子質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectrum of the VA prepared in our laboratory

從質(zhì)譜圖(圖3)來(lái)看，本實(shí)驗(yàn)室制備的VA標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)分子質(zhì)量為338，質(zhì)荷比(m/z)為337，并且未見其他雜質(zhì)峰，與國(guó)外Hamasaki等[17]報(bào)道的結(jié)果一致。

2.3 VA標(biāo)準(zhǔn)品的純度分析及紫外特征吸收檢測(cè)

用分析型高效液相色譜分析上述的VA標(biāo)準(zhǔn)品，檢測(cè)表明無(wú)其他雜質(zhì)峰出現(xiàn)(圖4)，目的峰純度達(dá)到99.99%，并且其在波長(zhǎng)288nm處有明顯的紫外特征吸收(圖5)。

圖4 VA標(biāo)準(zhǔn)品的色譜純度分析Fig.4 Analytical HPLC chromatogram of the VA prepared in our laboratory

圖5 VA標(biāo)準(zhǔn)品的紫外特征吸收?qǐng)D譜Fig.5 UV absorption spectrum of the VA prepared in our laboratory

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

在測(cè)定的質(zhì)量濃度范圍(100～1250ng/mL)內(nèi)，VA的質(zhì)量濃度與峰面積具有較好的線性關(guān)系，經(jīng)計(jì)算得到其線性回歸方程為y = 0.0212x+13.477，相關(guān)系數(shù)R=0.99932。工作曲線見圖6。

圖6 VA的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of VA

2.5 回收率、精密度和檢測(cè)限

在已知不含VA的20g大米對(duì)照品中，分別加入600、800、1100ng標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)劑量設(shè)3個(gè)平行，按1.2.2節(jié)中的方法提取，凈化和測(cè)定VA的含量，計(jì)算回收率及變異系數(shù)，結(jié)果見表2。由表可知，平均回收率為94.59%，平均變異系數(shù)為7.45%。該方法檢測(cè)VA的最低檢測(cè)限為50ng/mL(RSN＞3)。

表2 方法回收率和精密度測(cè)定Table 2 Average recoveries of 3 replicates of VA in a blank rice sample spiked at 3 levels

2.6 大米污染樣品的檢測(cè)

圖7 大米污染樣品(培養(yǎng)7d)的檢測(cè)圖譜Fig.7 Analytical HPLC chromatogram of rice artificially contaminated with Aspergillus parasiticus GIM3395 (cultivated for 7 days)

用上述HPLC方法對(duì)被寄生曲霉污染的大米樣品進(jìn)行檢測(cè)，VA均能很好的在23.2min左右出峰，其分析圖譜見圖7。

檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，被寄生曲霉污染的大米在培養(yǎng)的第3天即可檢出VA，在24個(gè)樣品皿中，陽(yáng)性檢出率100%，對(duì)照組未檢出VA(表3)。

表3 VA在大米污染樣品中不同培養(yǎng)時(shí)間段的檢測(cè)結(jié)果Table 3 Results of determination of VA in rice artificially contaminated with Aspergillus parasiticus GIM3395 at different cultivation time points

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)半制備高效液相色譜分離，純化和LCM S鑒定，制備了V A標(biāo)準(zhǔn)品，該方法簡(jiǎn)便、快捷，不需要煩瑣的樣品前處理過(guò)程，并且制備的標(biāo)準(zhǔn)品純度較高，足以滿足一般的研究需求。另外，采用自裝硅膠柱成功地對(duì)污染了寄生曲霉的大米樣品進(jìn)行凈化，并且保持了較高的回收率、達(dá)到良好的凈化效果。整個(gè)方法具有良好的重現(xiàn)性，檢測(cè)限為50ng/mL，平均回收率達(dá)到94.59%，同TLC法相比較，更加靈敏、可靠。由于VA是黃曲霉毒素和雜色曲霉素的重要前體物，VA

的高量檢出可能會(huì)意味著黃曲霉毒素或雜色曲霉素(依污染菌種而不同)污染的潛在危險(xiǎn)。在實(shí)際樣品中的VA污染情況的調(diào)查研究正在進(jìn)行之中。

[1]LEE L S, BENNETT J W, CUCULLU A F, et al. Biosynthesis of aflatoxin B1. Conversion of versicolorin A to aflatoxin B1by Aspergillus parasiticus[J]. Agric Food Chem, 1976, 24: 1167-1170.

[2]JONES W R, STONE M P. Site-specific targeting of aflatoxin adduction directed by t riple helix formation in the major groove of oligodeoxyribonucleotides[J]. Nucleic Acids Research, 1998, 26(4): 1070-1075.

[3]WONG J J, SINGH R, HSIEH D P H. Mutagenicity of fungal metabolites related to aflatoxin biosynthesis[J]. Mutat Res, 1977, 44: 447-450.

[4]BERDY J, BOCA RATON F L. Handbook of antibiotic compounds [M]. New York: CRC Press, 1980: 189.

[5]WEHNER F C, THIEL P G, VAN RENSBURG S, et al. Mutagenicity to Salmonella typbimurium of some Aspergillus and Penicillium mycotoxins[J]. Mutat Res, 1978, 58: 193-203.

[6]朱潤(rùn)芝, 賴林泉, 李敬京, 等. 飼料中霉菌毒素生物學(xué)特性及其檢測(cè)防治的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)動(dòng)物檢疫, 2009, 26(6): 67-69.

[7]尹青崗, 王鋒, 陳井旺. 糧食中真菌毒素污染現(xiàn)狀及控制[J]. 糧食與油脂, 2009(4): 31-34.

[8]MCCORMICK S P, BOWERS E, BHATNAGAR D. High-performance liquid chromatographic procedure for determining the profiles of aflatoxin precursors in wildtype and mutant strains of Aspergillus parasiticus[J]. Chromatogr, 1988, 441: 400-405.

[9]BERRY R K, DUTTON M F, JENNAH M S. Separation of aflatoxin biosynthetic intermediates by high-performance liquid chromatography [J]. Chromatogr, 1984, 283: 421-424.

[10]LIANG S H, SKORY C D, LINZ J E. Characterization of the function of the ve-1A and ve-1B genes, involved in aflatoxin biosynthesis in Aspergillus parasiticus[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1996, 62: 4568-4575.

[11]CARY J W, EHRLICH K C, BLAND J M, et al. The aflatoxin biosynthesis cluster gene, aflX, encodes an oxidoreductase involved in conversion of versicolorin A to demethylsterigmatocystin[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2006, 72: 1096-1101.

[12]CHANG P K, KIMIKO Y, YU J J. The Aspergillus parasiticus estA-encoded esterase converts versicolonal hemiacetal acetate to versicolonal and versicolonal acetate to versicolonal in aflatoxin biosynthesis[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2004, 70: 3593-3599.

[13]DELMULLE B, DAEGER DE S, ADAMS A, et al. Development of a liquid chromatography/tandem mass spectrometry method for the simultaneous determination of 16 mycotoxins on cellulose filters and in fungal cultures, rapid commun[J]. Mass Spectrom, 2006, 20: 771-776.

[14]黃紅巖, 汪軍. 玉米中黃曲霉毒素提取方法的評(píng)價(jià)[J]. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)報(bào), 1999, 30(3): 241-244.

[15]張浩, 楊毅, 潘見. LC-MS測(cè)定花生中黃曲霉毒素的研究[J]. 安徽化工, 2007, 33(4): 68-69.

[16]張曉彤. 液相色譜檢測(cè)方法[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2000: 12-13.

[17]HAMASAKI T, HATSUDA Y, TERASHIMA N, et al. Studies on the metabolites of Aspergillus versicolor (Vuillemin) Tiraboschi[J]. Agric Biol Chern, 1967, 31: 11-17.

HPLC Determination of Versicolorin A in Aspergillus parasiticus Contaminated Rice

TAN Hui-yong，F(xiàn)ANG Ming-ying，WANG Heng-xin，YAO Dong-sheng，LIU Da-ling*
(Institute of Microbial Biotechnology, Jinan University, Guangzhou 510632, China)

A HPLC method was established for the determination of versicolorin A (VA) in Aspergillus parasiticus contaminated rice using the VA prepared in our laboratory as a

tandard, which was prepared from the fermented mycelia of Aspergillus parasiticus ATCC 36537 through organic solvent extraction followed by semi-preparative HPLC purification. Samples (like rice artificially contaminated with Aspergillus parasiticus GIM 3395 in this study) were extracted with acetone, cleaned up on a silica column and analyzed using a HPLC system equipped with a UV detector at 288 nm wavelength. Results showed that the standard curve of VA exhibited good linearity over the concentration range of 100 to 1250 ng/mL with more than 0.999 correlation coefficient. Average recoveries of 3 replicates of VA in a blank rice sample spiked at 3 levels were between 84.12% and 105.12% with an average relative standard deviation of less than 7.5%. The limit of detection was 50 ng/mL. This method proved to be sensitive, stable and economical and thus is most suitable for the quantification of VA in cereal grains.

versicolorin A；high performance liquid chromatography (HPLC)；column chromatography；UV detector

TS207.3；O657.72

A

1002-6630(2009)10-0254-05

2009- 11-18

譚輝勇(1986—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)榉肿用笇W(xué)與酶工程。E-mail：tanhuiyong253@163.com

*通信作者：劉大嶺(1963—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸飳W(xué)。E-mail：tldl@jnu.edu.cn