Taqman-MGB探針RT-PCR方法檢測(cè)食品中脊髓灰質(zhì)炎病毒

李 想，黃 一,2，潘良文,*，盧鐘山，張舒亞，呂 蓉，劉月明，高 琴

(1.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海 200135；2.華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院，上海 200237)

Taqman-MGB探針RT-PCR方法檢測(cè)食品中脊髓灰質(zhì)炎病毒

李 想1，黃 一1,2，潘良文1,*，盧鐘山1，張舒亞1，呂 蓉1，劉月明1，高 琴1

(1.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海 200135；2.華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院，上海 200237)

目的：建立食品中脊髓灰質(zhì)炎病毒Taqman-MGB探針實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法。方法：在脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組2A區(qū)設(shè)計(jì)引物和探針，對(duì)3種血清型脊髓灰質(zhì)炎病毒進(jìn)行單獨(dú)和同時(shí)檢測(cè)。通過(guò)參照分子建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)人工接種病毒的牡蠣、藍(lán)莓、生菜和水食品樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：建立的檢測(cè)體系分別高度特異于相應(yīng)血清型病毒檢測(cè)，對(duì)3種血清型脊髓灰質(zhì)炎病毒進(jìn)行單獨(dú)和同時(shí)檢測(cè)的下限均為2拷貝參照分子DNA。基于參照分子建立的4條標(biāo)準(zhǔn)曲線具有很好線性關(guān)系(R2＝0.999)和較高反應(yīng)效率(1.01～1.04)。對(duì)4種食品樣品的分析表明，建立的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法可穩(wěn)定檢測(cè)到各添加濃度脊髓灰質(zhì)炎病毒。結(jié)論：建立的Taqman-MGB探針實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)體系適于食品中脊髓灰質(zhì)炎病毒的檢測(cè)。

脊髓灰質(zhì)炎病毒；實(shí)時(shí)熒光RT-PCR；Taqman-MGB探針；食品；參照分子

近年來(lái)，由于食用受病毒污染食品而引起的疾病爆發(fā)已成為國(guó)際上重點(diǎn)關(guān)注的食品安全事件之一，其中源于腸道病毒而引發(fā)的疾病占67%以上。作為一種致病性腸道病毒，脊髓灰質(zhì)炎病毒(polioviruses，PVs)雖然已在全世界基本消滅，但由于脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗的廣泛使用，其突變株近幾年在多個(gè)國(guó)家引發(fā)了疫苗衍生脊髓灰質(zhì)炎病毒感染事件[1-3]。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，2009年1至11月間疫苗衍生脊髓灰質(zhì)炎病毒感染病例已升至151例，野生型病毒感染病例近1500例[4-5]。為了加強(qiáng)PVs的監(jiān)控，防止“病從口入”至關(guān)重要。由于PVs

主要在人類(lèi)排泄物和污水中存活，貝類(lèi)及某些即食性水果和蔬菜存在受病毒污染的風(fēng)險(xiǎn)[6-7]。因此建立食品中PVs快速高效檢測(cè)方法是保障食品安全的重要技術(shù)手段之一。

近幾年國(guó)內(nèi)外相繼報(bào)道了檢測(cè)PVs的巢式PCR、常規(guī)PCR及ELISA等方法[8-10]，這些檢測(cè)技術(shù)多以患兒的糞便或分泌物樣本為檢測(cè)目標(biāo)。與人類(lèi)排泄物相比，食品中病毒含量更低，干擾因子更加復(fù)雜，因此需要針對(duì)性和靈敏度更高的檢測(cè)方法。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于特征性DNA的檢測(cè)。其中近年發(fā)展起來(lái)的Taqman-MGB探針由于具有特異性好、靈敏度高、穩(wěn)定性好、優(yōu)化步驟簡(jiǎn)單、結(jié)果精確、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)而逐步應(yīng)用于檢測(cè)中[11-13]。本研究基于Taqman-MGB探針建立分別檢測(cè)血清Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒的快速、高靈敏度方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

血清Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型PVs滅活疫苗懸浮液由美國(guó)加州大學(xué)學(xué)者惠贈(zèng)，A9、A16、B2、B3和B5型滅活柯薩奇病毒和含GⅡ型諾如病毒糞便樣品購(gòu)自中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒預(yù)防控制研究所。

PBS緩沖液(0.14mol/L NaCl，0.003mol/L KCl，0.00175mol/L KH2PO4，0.01mol/L Na2HPO4，pH 7.5) 上海生工生物工程有限公司；甘氨酸緩沖液(0.1mol/L甘氨酸，0.3mol/L NaCl，pH9.5)；PEG 8000溶液(16% PEG 8000，0.525mol/L NaC1)；TIANamp病毒RNA提取試劑盒(產(chǎn)品序列號(hào)SD101) 天根生物科技有限公司；Prime ScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒(產(chǎn)品序列號(hào)DRR037A) 、Premix Ex TaqTM實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增試劑盒(產(chǎn)品序列號(hào) DRR039A) 寶生物工程有限公司；醋酸/硝酸混合纖維素濾膜(產(chǎn)品序列號(hào)R7SN20186) 密理博貿(mào)易有限公司；5810R型臺(tái)式離心機(jī)、Mastercycler Gradient PCR儀、Thermomixer comfort型恒溫混勻器 Eppendorf公司；ABI PRISM 7300型序列分析系統(tǒng) Applied Biosystems公司。

1.2 引物與探針

對(duì)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已公布的PVs 各病毒株cDNA序列進(jìn)行比對(duì)和分析，尋找各血清型間相對(duì)保守，與其他腸道病毒株同源性較低的區(qū)域，選擇PVs基因組2A區(qū)設(shè)計(jì)引物和探針。由于簡(jiǎn)并引物對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)效率影響較大，對(duì)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型PVs分別設(shè)計(jì)了一套特異性引物和探針FP1/RP1/Probe1、FP2/RP2/Probe2和FP3/RP3/Probe3(表1)，3對(duì)引物擴(kuò)增區(qū)域在3種血清型中所處位置相近。進(jìn)行Blast比對(duì)后，設(shè)計(jì)的引物和探針僅與脊髓灰質(zhì)炎病毒相關(guān)序列匹配。

表1 3種血清型脊髓灰質(zhì)炎病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)引物和探針Table 1 Primer and probe sets used for real-time RT-PCR detections of serotypes 1, 2 and 3 of polioviruses

1.3 病毒滅活疫苗、糞便樣品中病毒RNA提取

PVs滅活疫苗、含諾如病毒糞便、滅活柯薩奇病毒樣品使用TIANamp病毒RNA提取試劑盒進(jìn)行RNA提取和純化。

1.4 脊髓灰質(zhì)炎病毒滅活疫苗懸浮液中病毒拷貝數(shù)測(cè)定

分別取140μLⅠ、Ⅱ、Ⅲ型PVs滅活疫苗懸浮液(每種血清型取10-4、10-5和10-63個(gè)稀釋液)進(jìn)行病毒RNA提取，采用本研究建立的實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)體系進(jìn)行擴(kuò)增，重復(fù)3次，通過(guò)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品病毒拷貝數(shù)。經(jīng)計(jì)算Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型PVs懸浮液濃度分別為2.52×106、5.36×106拷貝/μL和6.55×106拷貝/μL。

1.5 食品樣品中病毒的人工接種

1.5.1 貝類(lèi)和果蔬樣品

稱(chēng)取5g牡蠣腸腺組織，將140μL分別為2700、270和54拷貝Ⅰ型脊髓灰質(zhì)炎病毒懸浮液注入牡蠣腸腺組織中，勻漿后轉(zhuǎn)移至50mL離心管中。

稱(chēng)取15g 新鮮藍(lán)莓或生菜樣品，將140μL分別為2700、270和54拷貝Ⅰ型脊髓灰質(zhì)炎病毒懸浮液均勻點(diǎn)種于蔬果外表面，室溫放置30min，使病毒懸浮液完全被蔬果表面吸附并干燥。

分別取一份不含脊髓灰質(zhì)炎病毒污染的貝類(lèi)或蔬果樣品作為陰性對(duì)照。Ⅱ型、Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒的接種方法同上。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒同時(shí)添加的樣品中每種血清型病毒分別占總量的1/3，接種方法同上。

1.5.2 水樣

分別取140μL為2700、270和54拷貝Ⅰ型脊髓灰質(zhì)炎病毒懸浮液加入100mL自來(lái)水中，充分混勻，室溫放置60min。同時(shí)制備一份不含脊髓灰質(zhì)炎病毒的100mL水樣作為陰性對(duì)照。Ⅱ型和Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒接種方法同上。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒同時(shí)添加的水樣中每種血清型病毒分別占總量的1/3，接種方法同上。

1.6 食品中脊髓灰質(zhì)炎病毒富集和RNA提取與純化

1.6.1 貝類(lèi)樣品

采用參考文獻(xiàn)[14]的方法。

1.6.2 果蔬樣品

將樣品放入50mL離心管中，加入35mL甘氨酸緩沖液，37℃振蕩30min。4℃ 9703r/min離心30min。轉(zhuǎn)移上清液至一新離心管，加入等體積PEG8000溶液，4℃放置過(guò)夜。4℃ 10629r/min離心30min，棄上清液。向沉淀中加入140μL PB S緩沖液使沉淀懸浮均勻。采用TIANamp病毒RNA提取試劑盒提取病毒RNA。

1.6.3 水樣

將100mL水樣分次通過(guò)直徑為47mm，孔徑為0.45μm的醋酸/硝酸混合纖維素濾膜進(jìn)行過(guò)濾；取出濾膜，平整放于聚乙烯薄膜袋中，加入113 1.2μL Buffer RL-carrier RNA混合液(TIANamp病毒RNA提取試劑盒)，劇烈振蕩30s；室溫浸泡濾膜20min，將液體完全轉(zhuǎn)移到15mL離心管中。采用TIANamp病毒RNA提取試劑盒提取病毒RNA。

1.7 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

反應(yīng)體系為10μL，包括1×緩沖液，0.5μL反轉(zhuǎn)錄酶混合液，0.5μL Oligo (dT) (0.125μmol/L)，5μL RNA溶液。反應(yīng)條件為：37℃，15min；85℃，5s。

1.8 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)和標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

反應(yīng)體系為20μL，包括1×Premix Ex Taq，上下游引物各0.2μmol/L，探針0.2μmol/L，1×ROX熒光染料，2μL病毒cDNA或參照分子DNA溶液。實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增條件為：95℃，10s；95℃，5s；60℃，31s；45個(gè)循環(huán)。

為了建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，將實(shí)驗(yàn)室前期工作構(gòu)建的3種參照分子DNA分別稀釋至106、105、104、103、102、10拷貝/μL。進(jìn)一步稀釋至5、2和1拷貝/μL用于檢測(cè)下限分析。對(duì)3種血清型病毒同時(shí)檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線制備，則采用含有等量3種參照分子的稀釋液，進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)瑢?對(duì)引物和探針混合后進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)均重復(fù)3次。在熒光擴(kuò)增曲線對(duì)數(shù)期選擇域值，獲得Ct值。以Ct值為橫坐標(biāo)，DNA拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)作圖即得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。PCR反應(yīng)效率通過(guò)以下公式計(jì)算：E= 10－1/曲線斜率－1。對(duì)人工接種的食品樣品中脊髓灰質(zhì)炎病毒的檢測(cè)，則通過(guò)上述獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線和方程計(jì)算拷貝數(shù)，并對(duì)3次重復(fù)間的拷貝數(shù)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)體系特異性測(cè)試

為了鑒定建立的檢測(cè)體系的特異性，以Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型PVs， B2、B3、B5、A9和A16型柯薩奇病毒及GⅡ型諾如病毒cDNA為模板，分別采用設(shè)計(jì)的3套引物和探針進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。采用引物和探針FP1/RP1/ Probe1進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，僅有Ⅰ型脊髓灰質(zhì)炎病毒cDNA模板產(chǎn)生明顯的擴(kuò)增曲線，以其他病毒或血清型cDNA(包括諾如病毒、柯薩奇病毒、Ⅱ、Ⅲ型PVs)為模板時(shí)均未出現(xiàn)熒光信號(hào)增幅(表2)。同樣地，利用引物和探針FP2/RP2/Probe2和FP3/RP3/Probe3進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，只有分別以Ⅱ型和Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒cDNA為模板才可見(jiàn)顯著的熒光增幅。因此，針對(duì)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型PVs建立的Taqman-MGB探針實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)體系分別高度特異于對(duì)應(yīng)血清型脊髓灰質(zhì)炎病毒檢測(cè)。

表2 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)體系特異性測(cè)試Table 2 Specificity tests of real-time RT-PCR detection systems for serotypes 1, 2 and 3 of polioviruses

2.23 種血清型脊髓灰質(zhì)炎病毒的單獨(dú)檢測(cè)

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

分別以106、105、104、103、102、10拷貝/μL 6個(gè)水平的參照分子pMD18-PV1、pMD18-PV2和pMD18-PV3 DNA為外標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。擴(kuò)增曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線和對(duì)應(yīng)方程見(jiàn)圖1A～1C。結(jié)果顯示，針對(duì)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型PVs檢測(cè)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線PCR反應(yīng)效率分別為1.04、1.01和1.03，均接近1，說(shuō)明擴(kuò)增反應(yīng)基本未受抑制因子影響。Ct值與模板拷貝數(shù)對(duì)數(shù)的相關(guān)系數(shù)(R2)均為0.999。對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR體系可重復(fù)性分析表明，Ct值標(biāo)準(zhǔn)偏差(s)均小于0.25，介于0.025至0.211之間(表3)，在可接受范圍內(nèi)，說(shuō)明建立的檢測(cè)體系具有較好的可重復(fù)性。因此針對(duì)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型PVs建立的實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)體系適于進(jìn)一步對(duì)食品樣品的檢測(cè)。

2.2.2 檢測(cè)下限分析

分別以5、2和1拷貝/μL三個(gè)參照分子DNA溶液為模板測(cè)試檢測(cè)體系靈敏度，每個(gè)濃度DNA重復(fù)檢測(cè)10次。結(jié)果顯示包括最低1拷貝/μL模板(2拷貝/反應(yīng))

在10次檢測(cè)中均可被穩(wěn)定檢出。因此，建立的3種實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)體系的檢測(cè)下限均為2拷貝參照分子DNA。

2.33 種血清型脊髓灰質(zhì)炎病毒的同時(shí)檢測(cè)

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備和檢測(cè)下限分析

為了滿足口岸快速檢測(cè)的要求和簡(jiǎn)化檢測(cè)流程，實(shí)現(xiàn)3種血清型病毒的同時(shí)檢測(cè)，本研究對(duì)建立的3個(gè)檢測(cè)體系進(jìn)行混合用于檢測(cè)。將上述針對(duì)3種血清型病毒分別設(shè)計(jì)的3套引物和探針進(jìn)行混合，對(duì)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件優(yōu)化后，建立了一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢測(cè)3種血清型PVs的實(shí)時(shí)熒光體系。

通過(guò)制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1D)可以看出，PCR反應(yīng)效率達(dá)1.01，相關(guān)系數(shù)為0.999。3次平行重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差值介于0.004至0.244之間(表3)。對(duì)體系的檢測(cè)下限分析表明，與對(duì)3種血清型病毒分別檢測(cè)的靈敏度相似，對(duì)3種血清型病毒同時(shí)檢測(cè)可擴(kuò)增到的最低模板量亦為2個(gè)拷貝參照分子DNA。

2.3.2 同時(shí)檢測(cè)與單獨(dú)檢測(cè)體系的比較

表3 基于參照分子的Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型PVs檢測(cè)體系可重復(fù)性分析Table 3 Repeatability of Ct values for serotypes 1, 2 and 3 of PVs detection based on the reference molecules

圖1 基于參照分子建立的適于3種血清型PVs單獨(dú)和同時(shí)檢測(cè)的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curves and amplification plots for three serotypes of PVs detections based on the reference molecules

表4 對(duì)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型PVs實(shí)施單獨(dú)檢測(cè)和同時(shí)檢測(cè)的比較Table 4 Comparison of separate and simultaneous detection of serotypes 1, 2 and 3 of PVs

本研究對(duì)3種血清型脊髓灰質(zhì)炎病毒實(shí)施單獨(dú)檢測(cè)和同時(shí)檢測(cè)的PCR擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行了比較。以3個(gè)水平樣品cDNA為模板，通過(guò)單獨(dú)與同時(shí)檢測(cè)體系對(duì)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型PVs的分析表明，平均Ct值差值平均值分別介于－0.11～0.043，－0.043～0.32，以及0.093～0.226之間；標(biāo)準(zhǔn)偏差值分別小于等于0.32，0.27和0.34(表4)。對(duì)3種血清型病毒實(shí)施單獨(dú)檢測(cè)與同時(shí)檢測(cè)的Ct值差異未達(dá)顯著水平，擴(kuò)增曲線基本重合。由此可見(jiàn)，對(duì)3種血清型PVs進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)與單獨(dú)檢測(cè)效果無(wú)顯著差異。

2.4 食品樣品中脊髓灰質(zhì)炎病毒的檢測(cè)

圖2 食品樣品中添加3個(gè)濃度PV3病毒的擴(kuò)增曲線Fig.2 Amplification plots of four food samples inoculated with PV3

為了鑒定建立的檢測(cè)體系對(duì)食品樣品中脊髓灰質(zhì)炎病毒的實(shí)際檢測(cè)效果，本研究選擇了易受病毒污染的4類(lèi)食品，包括牡蠣、藍(lán)莓、生菜和水進(jìn)行病毒人工接種。結(jié)果如圖2和表5所示，在4種食品樣品中分別添加I、II或III型2700、270和54拷貝病毒，擴(kuò)增曲線均可穩(wěn)定出現(xiàn)熒光增幅。拷貝數(shù)的RSD在1.8%至45.0%之間，相比較而言，較大的3個(gè)RSD值(42.8%、42.8%、45.0%)出現(xiàn)在添加濃度最低的54拷貝病毒的水樣中。同時(shí)添加3種血清型病毒的食品樣品檢測(cè)結(jié)果與單獨(dú)添加的結(jié)果相似，即當(dāng)病毒添加量低至54拷貝時(shí)，仍可穩(wěn)定獲得有熒光增幅的擴(kuò)增曲線，RSD值在3.8%至40.3%之間。因此，建立的脊髓灰質(zhì)炎病毒Taqman-MGB實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法適于食品中脊髓灰質(zhì)炎病毒的檢測(cè)。

表5 食品樣品中脊髓灰質(zhì)炎病毒的檢測(cè)Table 5 Detection of polioviruses in four inoculated food samples拷貝數(shù)

3 討 論

近年來(lái)，包括中國(guó)在內(nèi)的很多國(guó)家均發(fā)現(xiàn)了野生型和疫苗型PVs感染病例[1-3]。降低食源性PVs感染和擴(kuò)散是防控病毒流行的一個(gè)重要方面。由于貝類(lèi)、果蔬和水樣等食品樣品中病毒含量較低，建立特異性好、靈敏度高的檢測(cè)方法至關(guān)重要?；诖耍狙芯拷⒘薚aqman-MGB探針實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法用于食品中PVs檢測(cè)。Taqman-MGB探針能分辨出模板與探針結(jié)合區(qū)一個(gè)堿基的差別，檢測(cè)特異性高[16]，且MGB探針長(zhǎng)度在13～19個(gè)堿基[11]，對(duì)于突變度較高的病毒株間尋找適宜的檢測(cè)區(qū)域十分有利。

鑒于Taqman-MGB探針應(yīng)用的諸多優(yōu)點(diǎn)，本研究針對(duì)3種血清型PVs設(shè)計(jì)了3套引物和探針，每套引物和探針均高度特異于對(duì)應(yīng)血清型病毒檢測(cè)。3套引物和探針既可用于3種血清型病毒單獨(dú)檢測(cè)，也可混合用于3種血清型病毒的同時(shí)檢測(cè)，使用更加靈活，并且單獨(dú)檢測(cè)與同時(shí)檢測(cè)效果沒(méi)有顯著差異。以參照分子為外標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)下限分析表明建立的單獨(dú)和同時(shí)檢測(cè)體系可檢

測(cè)到的最低模板量為2拷貝，較前人建立的脊髓灰質(zhì)炎病毒RT-PCR檢測(cè)方法靈敏度提高至少一個(gè)數(shù)量級(jí)[8-9]。對(duì)4類(lèi)易受病毒污染的人工接種食品樣品分析表明，無(wú)論實(shí)施單獨(dú)檢測(cè)還是同時(shí)檢測(cè)，對(duì)添加低至54拷貝病毒的樣品均可穩(wěn)定檢測(cè)到熒光信號(hào)增幅。

因此本研究建立的脊髓灰質(zhì)炎病毒Taqman-MGB探針實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)方法適用于貝類(lèi)、水果、蔬菜和水等食品樣品中PVs的檢測(cè)。

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Detection of Polioviruses in Foodstuffs by Real-time RT-PCR Based on Taqman-MGB Probe

LI Xiang1，HUANG Yi1,2，PAN Liang-wen1,*，LU Zhong-shan1，ZHANG Shu-ya1，LIU Yue-ming1，GAO Qin1
(1. Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shanghai 200135, China；2. School of Bioengineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China)

This study was aimed to develop three sero-specific real-time RT-PCR detection systems based on Taqman-MGB probes for the assay of polioviruses in foodstuffs. Primer and Taqman-MGB probe sets based on the 2A region of poliovirus genome were designed to detect three serotypes of polioviruses separately and simultaneously. Four artificially inoculated food samples, including oyster, blueberry, lettuce and water were analyzed based on the established standard curves using three reference molecules as calibrators. Sensitivity tests suggested that at least 2 copies of the reference molecule DNA could be stably detected both in the separate and simultaneous detection systems. Good linearity with the correlation coefficient above 0.999 and high reaction efficiency (1.01－1.04) were observed in four standard curves employing serially diluted reference molecule DNA as the calibrator. Three serotypes of polioviruses in four inoculated samples were successfully detected using the established real-time RT-PCR detection systems. The developed real-time RT-PCR detection systems based on Taqman-MGB probes are most suitable for polioviruses detection in foodstuffs.

polioviruses；rea1-time RT-PCR；Taqman-MGB probe；foodstuffs；reference molecule

TS201.6；R155.5

A

1002-6630(2010)10-0200-06

2009-08-05

上海技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)專(zhuān)項(xiàng)(07DZ05026)；國(guó)家質(zhì)檢總局科研項(xiàng)目(2007B150)；科技部世博科技專(zhuān)項(xiàng)(2009BAK43B31)；上海市科委創(chuàng)新平臺(tái)服務(wù)項(xiàng)目(10DZ2294102)

李想(1978—)，女，工程師，博士，研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)。E-mail：idealne@163.com

*通信作者：潘良文(1966—)，男，研究員，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測(cè)。E-mail：pan888@126.com