超聲波對(duì)多酚氧化酶酶活力的影響及其機(jī)理

王文宗，李 琳，林鴻佳，陳 玲，李 冰*

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510640)

超聲波對(duì)多酚氧化酶酶活力的影響及其機(jī)理

王文宗，李 琳，林鴻佳，陳 玲，李 冰*

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510640)

以多酚氧化酶(PPO)為對(duì)象，研究不同超聲波條件對(duì)PPO酶活力的影響及其機(jī)理。結(jié)果表明：PPO酶活力隨著超聲時(shí)間增加而降低，隨著超聲波功率增大先略增大然后逐漸降低；在超聲波作用下PPO的穩(wěn)定溫度和pH值分別為40℃和6.8；經(jīng)超聲波處理后的PPO，其動(dòng)力學(xué)參數(shù)米氏常數(shù)Km增大、最大反應(yīng)速率Vmax減??；PPO二級(jí)結(jié)構(gòu)中β-轉(zhuǎn)角相對(duì)減少。

PPO；超聲波；酶活力

超聲波是一種頻率不小于20kHz的能量波，利用其振動(dòng)能量，能在介質(zhì)中產(chǎn)生強(qiáng)大的剪切力和高溫，來(lái)改變物質(zhì)組織結(jié)構(gòu)、狀態(tài)、功能[1]，加速或減慢這些改變過(guò)程，可以由此引發(fā)或強(qiáng)化物理、化學(xué)、生物等過(guò)程，通過(guò)提高或降低這些過(guò)程的質(zhì)量和效率，達(dá)到其他處理技術(shù)難以達(dá)到的效果。隨著超聲波技術(shù)研究的不斷深入，超聲波技術(shù)已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于食品加工工業(yè)中[2-3]。近年來(lái)，食品中酶的超聲活化和鈍化成為研究熱點(diǎn)，超聲波對(duì)α-淀粉酶、糖化酶[4]、乙醛還原酶、溶菌酶[5]都有一定的抑制或激活的作用。

酶促褐變是果蔬汁加工、儲(chǔ)藏過(guò)程中普遍存在的一種現(xiàn)象，不僅會(huì)改變果汁的色澤、風(fēng)味，還會(huì)造成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的流失，嚴(yán)重影響了食品的感官和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。多酚氧化酶(polyphenel oxidase，PPO)是食品中引起酶促褐變的一種重要的酶。傳統(tǒng)抑制果蔬汁酶促褐變的方法主要是加熱處理、驅(qū)除氧氣和添加褐變抑制劑等，但這些傳統(tǒng)方法都存在一定的弊端。目前新興的抑制酶促褐變的方法主要是物理法包括高靜壓法、高強(qiáng)度脈沖電場(chǎng)法、超濾法等。國(guó)外已將高靜壓法應(yīng)用于果汁和果醬的生產(chǎn)，然而高靜壓法對(duì)設(shè)備的耐壓能力要求高，使其在食品行業(yè)中的應(yīng)用受到了很大的限制；國(guó)外對(duì)高強(qiáng)度脈沖電場(chǎng)法的研究已進(jìn)入中試階段，國(guó)內(nèi)在這方面的研究尚屬于起步階段[6]；超濾法因其處理量小受到一定的限制。超聲波對(duì)酶促褐變的影響未查到相關(guān)報(bào)道。超聲波對(duì)酶作用是復(fù)雜的，既有抑制也有激活作用，這關(guān)鍵取決于超聲波作用的條件以及酶的種類，因此，通

過(guò)控制超聲作用條件，從而利用超聲波處理對(duì)酶的效應(yīng)來(lái)抑制果蔬汁的酶促褐變是可行的。通過(guò)超聲波對(duì)鮮榨蘋(píng)果汁進(jìn)行處理，很大程度地降低了酶促褐變的速度，改善了果汁色澤，增強(qiáng)了果汁的穩(wěn)定性。

研究不同超聲波條件對(duì)PPO酶活力的影響程度以及影響機(jī)理，對(duì)抑制食品加工中酶促褐變具有重要的作用。因此，本研究以PPO為研究對(duì)象，研究超聲波作用下不同超聲波條件對(duì)PPO酶活力的影響，以及超聲波作用下PPO二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，從而闡明超聲波對(duì)引起褐變的酶的影響機(jī)制，為食品加工過(guò)程中酶促褐變的抑制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PPO(1460U/mg) 美國(guó)Sigma公司分裝；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 廣州精科玻璃儀器有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

VCX500超聲波發(fā)生器 德國(guó)Sonics公司；UV-2102PC紫外分光光度計(jì) 上海尤尼柯有限公司；BS-300S精密電子天平 德國(guó)塞多利斯公司；MOS-450圓二色光譜儀 法國(guó)Bio-Logic公司。

1.3 方法

1.3.1 PPO酶活力的測(cè)定

采用分光光度計(jì)法，具體操作步驟參考Kruger等[7]的方法，并作部分修改。先將磷酸緩沖液、鄰苯二酚溶液及酶液分別放入30℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱15min，取1.6mL 0.1mol/L pH6.8的磷酸緩沖液、1.2mL 0.1mol/L鄰苯二酚及0.2mL酶液，混勻后立即在紫外分光光度計(jì)上于波長(zhǎng)420nm處測(cè)定該混合體系的吸光度，同時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)。每隔1min記錄一次吸光度，連續(xù)記錄3min。按照同樣方法平行測(cè)定3次。

1.3.2 不同超聲波條件對(duì)PPO酶活力的研究

1.3.2.1 超聲波功率密度對(duì)PPO活性的影響

固定超聲波作用時(shí)間為4min，占空比為0.5(即超聲波作用2s，停止2s)，超聲波介質(zhì)pH6.8，超聲波介質(zhì)溫度為4℃，超聲波功率密度分別為0、5、10、40、65、95、135W/cm2。

1.3.2.2 超聲波作用時(shí)間對(duì)PPO活性的影響

固定超聲波功率密度為65W/cm2，占空比為0.5，超聲波介質(zhì)pH6.8，超聲波介質(zhì)溫度為4℃，超聲波作用時(shí)間分別選取0、2、4、6、8、10、12min。

1.3.2.3 超聲波介質(zhì)pH值對(duì)PPO活性的影響

固定超聲波功率密度為65W/cm2，超聲波作用時(shí)間為4min，占空比為0.5，超聲波介質(zhì)溫度為4℃，超聲波介質(zhì)pH值分別為3.5、6、6.8、7.4、8、9、10。

1.3.2.4 超聲波介質(zhì)溫度對(duì)PPO活性的影響

固定超聲波功率密度為65W/cm2，超聲波作用時(shí)間為4min，占空比為0.5，超聲波介質(zhì)pH值為6.8，超聲波介質(zhì)溫度分別為10、20、30、40、50、60℃。

1.3.3 PPO的動(dòng)力學(xué)測(cè)定

采用不同濃度梯度的鄰苯二酚溶液，測(cè)定PPO的動(dòng)力學(xué)，用Line weaver-Burk雙倒數(shù)作圖模型[8]分別求出無(wú)超聲波處理和經(jīng)超聲波處理(超聲波介質(zhì)溫度為40℃，超聲波介質(zhì)pH6.8，超聲波作用時(shí)間為4min，超聲波功率密度為65W/cm2)PPO的米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vmax。Km表示酶和底物之間的親和能力；Vmax是酶被底物飽和時(shí)的反應(yīng)速度。

1.3.4 PPO二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定

稱取4mg PPO加入20mL 0.1mol/L pH6.8的磷酸鹽緩沖溶液，配成0.2mg/mL的PPO溶液經(jīng)超聲波處理(超聲波功率密度為65W/cm2，超聲波作用時(shí)間為4min，PPO溶液的溫度為40℃，pH6.8)，以0.1mol/L，pH6.8的磷酸緩沖溶液為空白溶液測(cè)定其圓二光譜。利用該圓二色光譜儀所配置的軟件包自動(dòng)計(jì)算酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)各組分的百分含量。對(duì)比樣品：0.2mg/mL的PPO溶液不經(jīng)超聲波作用直接測(cè)定其圓二光譜。

圓二色譜條件：掃描速度為100nm/min，帶寬1.0nm；掃描范圍190～250nm，重復(fù)掃描4次。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波處理?xiàng)l件對(duì)PPO酶活力的影響

2.1.1 超聲波功率密度對(duì)PPO酶活力的影響

圖1 超聲波功率密度對(duì)PPO酶活力的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on the activity of PPO

由圖1可見(jiàn)，當(dāng)超聲波功率密度小于10W/cm2，隨著超聲波功率密度的增大，PPO酶活力略有升高；而超聲波功率密度大于10W/cm2，隨著超聲波功率密度的增大，其酶活力迅速降低。在超聲波功率密度為40W/cm2時(shí)，其活性為原酶液的90.2%；而當(dāng)超聲波功率密度增

大至135W/cm2時(shí)，其活性僅為原酶液的33.8%。說(shuō)明低強(qiáng)度的超聲波對(duì)PPO有一定的激活作用，而高強(qiáng)度的超聲波則會(huì)抑制PPO活性。超聲波產(chǎn)生的機(jī)械傳質(zhì)作用和加熱作用增加了底物分子與酶分子的能量，使其運(yùn)動(dòng)性加強(qiáng)，相互間碰撞的概率增大，同時(shí)也加強(qiáng)了介質(zhì)與酶之間的傳質(zhì)擴(kuò)散過(guò)程，超聲波作用下產(chǎn)生的振動(dòng)的氣泡的周圍界面有利于介質(zhì)中的底物分子進(jìn)入酶活性中心，也有利于產(chǎn)物分子進(jìn)入介質(zhì)，從而提高了酶促反應(yīng)速度[9]。然而高強(qiáng)度超聲波處理酶溶液時(shí)會(huì)出現(xiàn)空化效應(yīng)，空化效應(yīng)瞬間產(chǎn)生高溫(大于5000K)、高壓(大于5×107Pa)、高能量密度沖擊波(可高達(dá)108N/m2)、微射流(速度達(dá)可400km/h)等極端物理作用[10]，而酶分子在強(qiáng)大的沖擊波或射流的作用下，分子結(jié)構(gòu)被破壞甚至被剪切成小碎片而表現(xiàn)出活力下降甚至失活[9]。這與文獻(xiàn)[11]所報(bào)道“隨著超聲功率的增加SOD活性先增大后減小”的結(jié)論一致。

最后，教師引入自變量與因變量、無(wú)關(guān)變量與額外變量的概念進(jìn)行歸納總結(jié)。學(xué)生理解各類變量概念以及變量之間的關(guān)系，學(xué)會(huì)確定變量。

2.1.2 超聲波作用時(shí)間對(duì)PPO酶活力的影響

圖2 超聲波作用時(shí)間對(duì)PPO酶活力的影響Fig.2 Effect of ultrasonic exposure time on the activity of PPO

由圖2可見(jiàn)，隨著超聲時(shí)間的增加，PPO酶活力呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)。PPO經(jīng)過(guò)6min的超聲波處理后，其活性顯著降低，活性為原酶液的42.5%。當(dāng)超聲處理時(shí)間超過(guò)6min時(shí)，隨著時(shí)間的增加酶活力雖仍有略微的下降，但變化幅度較小，說(shuō)明超聲處理一定時(shí)間后，繼續(xù)延長(zhǎng)超聲處理時(shí)間對(duì)PPO活性的影響較小。這與文獻(xiàn)[12]所報(bào)道的隨著超聲時(shí)間的增加胰蛋白酶活性變化規(guī)律一致。這可能是因?yàn)槌暡óa(chǎn)生自由基和空化效應(yīng)使PPO的構(gòu)象產(chǎn)生了變化，從而使其酶活力在短時(shí)間內(nèi)迅速降低；但由于酶的結(jié)構(gòu)具有柔性，繼續(xù)延長(zhǎng)超聲處理時(shí)間，對(duì)PPO結(jié)構(gòu)不會(huì)再有太大影響。

2.1.3 超聲波介質(zhì)pH值對(duì)PPO酶活力的影響

由圖3可見(jiàn)，當(dāng)介質(zhì)pH值為6.8時(shí)，PPO的活性最大，而一旦增加或減少介質(zhì)的pH值，使其偏離6.8后，均表現(xiàn)出酶活力的下降。這說(shuō)明超聲波作用下PPO的穩(wěn)定pH值為6.8左右，這與圖3中無(wú)超聲波作用下PPO穩(wěn)定pH值為6.8，基本一致，由此可知，超聲波作用并沒(méi)有影響PPO的穩(wěn)定pH值條件。

圖3 超聲波作用下pH值對(duì)PPO酶活力的影響Fig.3 Effect of pH on the activity of PPO with ultrasonic exposure

2.1.4 超聲波介質(zhì)溫度對(duì)PPO酶活力的影響

圖4 超聲波作用下溫度對(duì)PPO酶活力的影響Fig.4 Effect of temperature on the activity of PPO with ultrasonic exposure

由圖4可知，當(dāng)溫度為40℃時(shí)，PPO的酶活力最大；而低于40℃或高于40℃時(shí)，均表現(xiàn)為酶活力的下降；在溫度為60℃時(shí)，PPO的活性基本消失。這說(shuō)明PPO的酶活力最高溫度為40℃左右，溫度過(guò)低時(shí)，會(huì)使酶的活性受到抑制；而溫度過(guò)高則會(huì)破壞酶的空間構(gòu)象，造成酶的失活。無(wú)超聲波作用的PPO的穩(wěn)定溫度為40℃，與經(jīng)過(guò)超聲波作用的PPO的酶穩(wěn)定溫度完全一致。由此可知，超聲波并沒(méi)有影響酶的穩(wěn)定溫度條件。

圖5 無(wú)超聲波作用下和經(jīng)過(guò)超聲波作用PPO酶活力動(dòng)力學(xué)曲線Fig.5 Kinetic curves of PPO with and without ultrasonic exposure

由表1得知，無(wú)超聲波作用的PPO的Km=0.94×10-2mol/L，Vmax=0.8652ΔA/min；經(jīng)超聲波作用的PPO的

Km=1.09×10-2mol/L，Vmax=0.7638ΔA/min?？梢钥闯?，經(jīng)過(guò)超聲波作用后的PPO的米氏常數(shù)Km有所增大，最大反應(yīng)速率Vmax有所減小，這表明超聲波作用使PPO與底物的親和力減弱了。由于米氏常數(shù)只與酶的性質(zhì)有關(guān)，在較高強(qiáng)度的超聲作用下，酶分子的能量進(jìn)一步加大，構(gòu)象進(jìn)一步改變，趨向不合理的構(gòu)象，導(dǎo)致酶分子本身的催化活力受到阻礙[9]。因此，可推測(cè)超聲波作用改變了PPO活性中心的結(jié)構(gòu)或者是酶的構(gòu)像，從而導(dǎo)致其與底物親和力的改變。

表1 無(wú)超聲波作用和經(jīng)過(guò)超聲波作用的PPO酶活力動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 1 Kinetic parameters of PPO with and without ultrasonic exposure

2.3 超聲波對(duì)PPO二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

圖6 無(wú)超聲波作用與經(jīng)過(guò)超聲波作用PPO的圓二色譜圖Fig.6 CD spectra of PPO with and without ultrasonic exposure

表2 PPO圓二色譜的分析結(jié)果Table 2 CD spectral data of PPO with and without ultrasonic exposure %

由表1可以看出，經(jīng)超聲波作用后PPO蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋、β-折疊結(jié)構(gòu)略有減少，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)減少了4.2%，無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)增加了約6.4%。蛋白質(zhì)分子中α-螺旋和β-折疊的穩(wěn)定性主要取決于分子內(nèi)部的氫鍵。在酶蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋和β-折疊是維系其空間結(jié)構(gòu)的骨架結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)中存在較多的氫鍵，導(dǎo)致規(guī)則二級(jí)結(jié)構(gòu)具有一定的穩(wěn)定性和剛性；β-轉(zhuǎn)角及無(wú)規(guī)卷曲中氫鍵作用微弱，使肽段中的各個(gè)殘基間有更大的自由度[13]，因此，超聲波產(chǎn)生強(qiáng)大的沖擊波或射流[9]對(duì)β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的氫鍵影響較大，導(dǎo)致對(duì)PPO二級(jí)結(jié)構(gòu)中β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)破壞較大。

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用不同條件的超聲波處理，可以不同程度抑制PPO的酶活力。隨著超聲波功率的增大，PPO酶活力先略有升高，然后逐漸降低；PPO酶活力隨著超聲波作用時(shí)間的增大逐漸減小，而單一延長(zhǎng)超聲波處理的總時(shí)間，對(duì)PPO酶活力的影響較小。超聲后的PPO的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km增大、Vmax減少。通過(guò)圓二色譜分析可以看出，超聲波是通過(guò)改變酶分子的結(jié)構(gòu)進(jìn)而影響其活性的。當(dāng)超聲波作用于酶溶液時(shí)，超聲波釋放的能量作用于酶分子，可能導(dǎo)致維持二級(jí)結(jié)構(gòu)的氫鍵的斷裂，導(dǎo)致部分構(gòu)象發(fā)生變化，導(dǎo)致酶分子的構(gòu)象趨于不合理，從而影響酶活力，抑制酶促反應(yīng)。

[1] SORIA A C, VILLAMIEL M. Effect of ultrasound on the technological properties and bioactivity of food: A review[J]. Trends in Food Science & Technology, 2010, 21(7): 323-331.

[2] de la FUENTE-BLANCO S, RIERA-FRANCO de SARABIA E, ACOSTA-APARICIO V M, et al. Food drying process by power ultrasound[J]. Ultrasonics, 2006, 44(1): 523-527.

[3] VILKHU K, MAWSON R, SIMONS L, et al. Applications and opportunities for ultrasound assisted extraction in the food industry: A review [J]. Innovative Food Science & Emerging Technologies, 2008, 9(2): 161-169.

[4] BARTON S, BULLOCK C, WEIR D. The effects of ultrasound on the activities of some glycosidase enzymes of industrial importance[J]. Enzyme Microb Technol, 1996, 18(3): 190-194.

[5] COAKLEY W T, BROWN R C, JAMES C J, et al. The inactivation of enzymes by ultrasonic cavitation at 20 kHz[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1973, 159(2): 722-729.

[6] 唐貴芳, 趙秋艷, 喬明武, 等. 蘋(píng)果汁酶促褐變抑制方法的比較[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2008, 24(10): 122-126.

[7] KRUGER J E, HATCHER D W, DEPAUW R. A whole seed assay for poly-phenol oxidase in canadian prairie spring wheats and its usefulness as a measure of nodle darkening[J]. Cereal Chem, 1994, 71(4): 324-326.

[8] LINEWEAVER H, BURK D. The determination of enzyme dissociation constants[J]. J Amer Chem Soc, 1934, 56: 658-666.

[9] 呂鵬, 莊重, 凌建亞, 等. 超聲對(duì)酶的影響[J]. 生物技術(shù)通訊, 2004, 15(5): 534-536.

[10] GONG C L, HART D P. Ultrasound induced cavitation and sonochemical yields[J]. Journal of Acoustical Society of American, 1998, 104(5): 2675-2682.

[11] 錢春梅, 譚兆贊, 李云, 等. 超聲波對(duì)菜豆種子超氧化物歧化酶活性的影響[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 25(3): 73-77.

[12] TIAN Zhongmin, WAN Mingxi, WANG Supin, et al. Effects of ultrasound and additives on the function and structure of trypsin[J]. Ultrasonic Sonochemistry, 2004, 11(6): 399-404.

[13] 閻隆飛, 孫之榮. 蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)[M]. 北京: 清華大學(xué)出版社, 1999: 36-37.

Effect and Mechanisms of Ultrasonic Treatment on Polyphenol Oxidase Activity

WANG Wen-zong，LI Lin，LIN Hong-jia，CHEN Ling，LI Bing*
(College of Light Industry and Food Science, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)

The effects of different ultrasonic treatment conditions on polyphenol oxidase (PPO) activity were investigated. Meanwhile, related mechanisms were explored. The results indicated that with prolonged ultrasonic treatment time, PPO activity initially increased, followed by a decrease. Higher ultrasonic power resulted in a slight increase followed by a gradual decrease. The stable temperature and pH for PPO treated by ultrasonic were respectively 40 ℃ and 6.8, respectively. After ultrasonic treatment, an increase in the Kmof PPO and a decrease in its Vmaxwere simultaneously observed, and the content of β-turn secondary structures decreased.

polyphenol oxidase；ultrasonic；enzyme activity

TS255.44

A

1002-6630(2010)17-0331-04

2010-06-29

國(guó)家“863”計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2007AA100405)；廣東省教育廳產(chǎn)學(xué)研基地科技成果轉(zhuǎn)化重大項(xiàng)目(cgzhzd0704)；科技部國(guó)際科技合作計(jì)劃項(xiàng)目(2009DFA32070)

王文宗(1985—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)樘穷愇镔|(zhì)及其藥物的制備與生物利用。

E-mail：wangwenzong@126.com

*通信作者：李冰(1972—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)樘穷愇镔|(zhì)及其藥物的制備與生物利用。

E-mail：bli@scut.edu.cn