牛乳鐵素對(duì)幾種免疫細(xì)胞因子的影響

胡志和，劉傳國(guó)，李 娜，龐廣昌，陳慶森

(天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134)

牛乳鐵素對(duì)幾種免疫細(xì)胞因子的影響

胡志和，劉傳國(guó)，李 娜，龐廣昌，陳慶森

(天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134)

通過對(duì)灌胃牛乳鐵素(LfcinB)后小鼠血清中細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10和TNF-α水平的變化，評(píng)價(jià)其免疫調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明，灌胃牛乳鐵素后3h采血，分離其血清，用ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞因子，與陰性對(duì)照組相比，對(duì)細(xì)胞因子IL-2和TNF-α產(chǎn)生極顯著促進(jìn)作用(P≤0.01)，對(duì)抗炎細(xì)胞因子IL-4有極顯著的抑制作用(P≤0.01)，對(duì)IL-6有顯著的抑制作用(P≤0.05)，對(duì)抗炎細(xì)胞因子IL-10的分泌影響也極顯著(P≤0.01)，并且IL-10隨TNF-α的增強(qiáng)而增強(qiáng)，起到平衡作用。因此，口服牛乳鐵素對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠具有免疫增強(qiáng)和調(diào)節(jié)作用。

牛乳鐵素；細(xì)胞因子；免疫調(diào)節(jié)

牛乳鐵素(LfcinB)來源于牛乳鐵蛋白的第17～41位氨基酸，由25個(gè)氨基酸殘基組成，氨基酸序列為：FKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAF，包括5個(gè)精氨酸、3個(gè)賴氨酸和2個(gè)色氨酸殘基，具有強(qiáng)堿性，pI大于8.5，相對(duì)分子質(zhì)量3100，由2個(gè)Cys通過形成分子內(nèi)二硫鍵使LfcinB分子呈不完全的桶狀，其中的11個(gè)氨基酸(RRWQWRMKKL)具有與完整的LfcinB相同的抗菌活性，而且這11個(gè)氨基酸殘基中富含Trp/Arg的區(qū)域(RRWQWR)是保持抗菌活性所必須的[1-3]，堿性的Arg殘基和疏水的Trp殘基，形成了兩性分子結(jié)構(gòu)。對(duì)含有25個(gè)氨基酸殘基的LfcinB也是兩性分子結(jié)構(gòu)；Trp殘基和帶正電荷的Arg、Lys殘基是相互分開的。以上結(jié)構(gòu)特征與LfcinB功能是分不開的，對(duì)LfcinB結(jié)合膜和抗菌活性尤其重要的是Trp和Arg，它們引導(dǎo)整個(gè)分子結(jié)合在界面上，而非滲入到雙層膜之內(nèi)，并在那里通過結(jié)合DNA和RNA分子繼續(xù)作用?？傊琇fcin的各種活性似乎都與其分子的特殊部分Trp/Arg有關(guān)[4]。LfcinB帶有強(qiáng)正電荷的陽離子型抗菌肽，可能通過趨化性來達(dá)到調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和消炎的功能[5]。有研究者認(rèn)為，可能是LfcinB能自發(fā)穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，選擇性地同某些與免疫效應(yīng)有關(guān)的基因結(jié)合，從而促進(jìn)或抑制這些基因的表達(dá)，調(diào)控免疫反應(yīng)[6]。另有研究表明，LfcinB能夠進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)或核中，可以作為第二信使啟動(dòng)某一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)控基因表達(dá)。影響細(xì)胞功能，如促進(jìn)骨髓細(xì)胞增殖、中性淋巴細(xì)胞激活、促進(jìn)細(xì)胞分化等[7]。口服乳鐵素可增加外周血液和產(chǎn)腫瘤鼠的小腸中NK細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的數(shù)量，乳鐵素通過老鼠的小腸上皮細(xì)胞可誘導(dǎo)IL-18的分泌[8-10]，從而增強(qiáng)Th1

細(xì)胞的功能和增加NK細(xì)胞的活性。

本研究通過檢測(cè)灌胃乳鐵素后免疫低下小鼠部分免疫細(xì)胞因子分泌的變化，探討乳鐵素在免疫調(diào)節(jié)方面的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Balb/c小鼠((6～8周齡，18～22g)，雌雄各半) 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的二級(jí)種(批準(zhǔn)號(hào)：京動(dòng)字8910 M 047)。

1.2 試劑

藥用環(huán)磷酰胺(批號(hào)為012034) 上海華聯(lián)制藥有限公司；牛乳鐵素(純度≥95%) 實(shí)驗(yàn)室自制；IL-2、IL-4、IL-6、IL-10和TNF-α定量ELISA檢測(cè)試劑盒 美國(guó)Rapidbio公司。

1.3 儀器與設(shè)備

UV-2100型分光光度計(jì) 美國(guó)Unico公司；Mμltiskan MK3酶標(biāo)儀 Thermo Labsystems公司；KDC-2046低速冷凍離心機(jī) 科大創(chuàng)新有限公司。

1.4 方法

1.4.1 免疫低下模型的建立

根據(jù)文獻(xiàn)[11]的方法建立免疫低下模型，選擇腹腔注射80mg/kg bw的環(huán)磷酰胺后第3天的Balb/c小鼠為免疫低下模型。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理

1.4.2.1 不同劑量的牛乳鐵素對(duì)IL-2分泌的影響

取小鼠50只，雌雄兼用，隨機(jī)分為5組，每組10只。設(shè)3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別以400、40、4μg/mL的牛乳鐵素每天灌胃，灌胃劑量為20mL/kg bw，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組和完全空白組，給這兩組每天灌胃生理鹽水，灌胃劑量為20mL/kg bw，連續(xù)灌胃15d。末次灌胃后次日，給實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組小鼠一次性腹腔注射80mg/kg bw的環(huán)磷酰胺，注射劑量為10mL/kg bw；之后實(shí)驗(yàn)組按照原劑量灌胃牛乳鐵素；陰性對(duì)照組灌胃生理鹽水；而完全空白組僅灌胃生理鹽水，劑量為20mL/kg bw，連續(xù)3d。第3天，在灌胃乳鐵素或生理鹽水后3h，摘眼球取血，每只小鼠取血0.6～0.8mL置入1.5mL離心管中，靜置1h左右，于2000r/min離心10min，取上清。用IL-2定量ELISA法檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，同時(shí)確定牛乳鐵素較適合的灌胃劑量。

1.4.2.2 不同作用時(shí)間同等劑量的牛乳鐵素對(duì)IL-4、IL-6、IL-10和TNF-α分泌的影響

取60只小鼠，隨機(jī)分為6組，設(shè)為完全空白組、陰性對(duì)照組，其他4組為牛乳鐵素實(shí)驗(yàn)組。首先給陰性對(duì)照組和4個(gè)實(shí)驗(yàn)組的小鼠一次性腹腔注射80mg/kg bw的環(huán)磷酰胺，注射劑量均為10mL/kg bw；之后實(shí)驗(yàn)組灌胃40μg/mL牛乳鐵素，劑量為20mL/kg bw，陰性對(duì)照組灌胃生理鹽水，劑量為20mL/kg bw，連續(xù)灌胃3d；完全空白組灌胃生理鹽水，劑量為20mL/kg bw，連續(xù)3d。第3天，實(shí)驗(yàn)組分別在灌胃后1、2、3h和4h，摘眼球取血。完全空白組和陰性對(duì)照組在第2小時(shí)和第3小時(shí)之間取血。每只小鼠取血0.6～0.8mL置入1.5mL離心管中，靜置1h左右，于2000r/min離心10min，取上清。檢測(cè)IL-4、IL-6、IL-10和TNF-α的變化。

1.4.3 細(xì)胞因子定量檢測(cè)

采用ELISA試劑盒檢測(cè)，送至天津華生源科技有限公司完成。具體操作步驟見試劑盒操作說明。

1.4.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0軟件處理，以x±s表示，用t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同劑量牛乳鐵素對(duì)IL-2的影響

圖1 不同劑量牛乳鐵素對(duì)小鼠IL-2分泌的影響Fig.1 Effect of lactoferricin on IL-2 in mice

由圖1可知，隨著每天攝入牛乳鐵素質(zhì)量濃度的增加，IL-2到達(dá)一個(gè)峰值之后略有下降趨勢(shì)，以40μg/mL為最佳值。與陰性對(duì)照組相比，3個(gè)劑量組對(duì)IL-2都具有極顯著的影響(P≤0.01)。

2.2 不同作用時(shí)間下牛乳鐵素對(duì)IL-4分泌的影響

圖2 不同作用時(shí)間下牛乳鐵素對(duì)小鼠IL-4分泌的影響Fig.2 Effect of lactoferricin on IL-4 in mice

由圖2可知，牛乳鐵素對(duì)IL-4水平的影響隨著時(shí)間的變化而變化，在1～3h范圍內(nèi)，對(duì)IL-4的分泌抑制作用增強(qiáng)，之后逐漸減弱，在3h時(shí)達(dá)到最強(qiáng)。因此，牛乳鐵素對(duì)小鼠IL-4的分泌具有抑制作用。與陰性對(duì)照組相比，在2h和3h抑制作用極顯著(P≤0.01)，1h和4h抑制作用則受到顯著影響(P≤0.05)。

2.3 不同作用時(shí)間下牛乳鐵素對(duì)IL-6分泌的影響

圖3 不同作用時(shí)間下牛乳鐵素對(duì)小鼠IL-6分泌的影響Fig.3 Effect of lactoferricin on IL-6 in mice

由圖3可知，牛乳鐵素對(duì)IL-6的分泌具有抑制作用。在1～3h范圍內(nèi)，對(duì)IL-6分泌的抑制作用增強(qiáng)，之后逐漸減弱，在3時(shí)達(dá)到顯著水平(P≤0.05)。而在1、2h和4h，雖有抑制作用，但不顯著。

2.4 不同作用時(shí)間下牛乳鐵素對(duì)IL-10分泌的影響

圖4 不同作用時(shí)間下牛乳鐵素對(duì)小鼠IL-10分泌的影響Fig.4 Effect of lactoferricin on IL-10 in mice

由圖4可知，灌胃牛乳鐵素對(duì)IL-10的分泌具有促進(jìn)作用。在灌胃后1～3h內(nèi)，其作用逐漸增強(qiáng)。在3h時(shí)IL-10質(zhì)量濃度達(dá)到最強(qiáng)，是陰性對(duì)照組的63倍多，是完全空白組的近12倍。隨后其作用開始減弱。并且，與陰性對(duì)照組相比，1～4h內(nèi)均達(dá)到極顯著差異(P≤0.01)。

2.5 不同作用時(shí)間下牛乳鐵素對(duì)TNF-α分泌的影響

圖5 不同作用時(shí)間下牛乳鐵素對(duì)小鼠TNF-α分泌的影響Fig.5 Effect of lactoferricin on TNF-α in mice

由圖5可知，牛乳鐵素對(duì)小鼠TNF-α的分泌具有促進(jìn)作用。在灌胃牛乳鐵素后1～3h內(nèi)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，牛乳鐵素對(duì)小鼠TNF-α分泌的影響也隨之增大，在3h時(shí)達(dá)到最高。隨后，其作用開始減弱。在3h時(shí)牛乳鐵素對(duì)小鼠TNF-α分泌的影響達(dá)到極顯著水平(P≤0.01)，在2h和4h時(shí)牛乳鐵素對(duì)小鼠TNF-α的影響達(dá)顯著水平(P≤0.05)。

3 討 論

乳鐵素作為乳鐵蛋白的活性中心，具有乳鐵蛋白的各種生理活性。在免疫研究方面，發(fā)現(xiàn)乳鐵蛋白能夠與靶分子和靶細(xì)胞作用，起到調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的作用。通過抑制前炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生起到抗炎作用[12-14]，并能夠上調(diào)抗炎細(xì)胞因子的作用[15]。乳鐵蛋白通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞和B細(xì)胞的增殖、分化和激活，直接或間接增強(qiáng)免疫反應(yīng)[16-17]。Hartog等[18]研究發(fā)現(xiàn)，口服乳鐵蛋白抑制炎癥反應(yīng)在一定濃度范圍內(nèi)(0.1～1mg/(mouse/day))有效，而高濃度(5～25mg/(mouse/day))時(shí)作用不明顯。Tomita等[19]指出，口服乳鐵蛋白能夠增強(qiáng)腸內(nèi)上皮細(xì)胞IL-18、上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞的IL-10和INF-γ的分泌。能夠增加腸黏膜中CD4+細(xì)胞、CD8+細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞數(shù)量。同時(shí)還能增強(qiáng)小腸中NOD-2、IFN-β和IL-12p40的表達(dá)。在全身免疫系統(tǒng)中，口服乳鐵蛋白能增加淋巴結(jié)和脾中細(xì)胞的數(shù)量，增加腹膜巨噬細(xì)胞和脾的NK細(xì)胞的活性，增強(qiáng)Th1型細(xì)胞因子(IL-12和INF-γ)的產(chǎn)生。

圖6 口服乳鐵蛋白對(duì)宿主保護(hù)作用機(jī)理的推演Fig.6 Protective mechanism of oral administration of lactoferricin on host

然而，食用乳鐵蛋白后，在胃-腸道中部分被水解，產(chǎn)生包括乳鐵素(LfcinB)在內(nèi)的肽類[20]。乳鐵蛋白及其水解產(chǎn)物能否進(jìn)入血液循環(huán)發(fā)揮作用。根據(jù)Wakabayashi等[21]研究結(jié)果，攝入的乳鐵蛋白一般不會(huì)直接進(jìn)入血液。而Fischer等[22]研究表明，乳鐵蛋白攝

入后，可以完整分子的形式通過小腸被轉(zhuǎn)運(yùn)到外周血，并在口服10～20min后停留在肝臟、腎臟、膽囊、脾臟等器官。但它又是如何作用于腸道免疫系統(tǒng)，影響其宿主防御呢？根據(jù)Tomita等[19]對(duì)口服乳鐵蛋白作用機(jī)理推演(圖6)，乳鐵蛋白攝入后，部分被胃腸道中的蛋白酶水解成乳鐵素等肽類，乳鐵蛋白及其水解產(chǎn)物與腸細(xì)胞和腸上皮中的免疫細(xì)胞(包括樹突細(xì)胞、淋巴細(xì)胞)上的受體結(jié)合，或被細(xì)胞吞噬，并激活細(xì)胞內(nèi)的信使核糖核酸的形成基因，通過細(xì)胞因子和體液因子及免疫細(xì)胞的遷移使腸道免疫系統(tǒng)作用于病灶。然而，乳鐵素作為乳鐵蛋白食用后產(chǎn)生的水解產(chǎn)物，在其中的作用如何呢？

細(xì)胞因子的產(chǎn)生，與乳鐵蛋白的活性中心——乳鐵素的結(jié)構(gòu)和氨基酸的組成有密切關(guān)系，通過乳鐵素的氨基酸組成(FKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAF)可以看出，在牛乳鐵素的25個(gè)氨基酸中有5個(gè)精氨酸(R)，占其氨基酸的1/5，因此，在該活性中心，精氨酸有著非常重要的作用。精氨酸可有效促進(jìn)細(xì)胞免疫功能，使胸腺增大和細(xì)胞計(jì)數(shù)增多；刺激T淋巴細(xì)胞的增殖；增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力和自然殺傷細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的溶解功能，促進(jìn)脾臟單核細(xì)胞合成IL-2并提高IL-2的活性及IL-2受體的活性；降低前列腺素G2的水平，進(jìn)一步促進(jìn)IL-2合成，最終發(fā)揮免疫防御和免疫調(diào)節(jié)作用[23]。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果也證實(shí)，乳鐵素確實(shí)能夠提高IL-2的水平。另外，乳鐵素對(duì)細(xì)胞因子的產(chǎn)生作用，與攝入的劑量有關(guān)，這一點(diǎn)在文獻(xiàn)[11]已經(jīng)得到驗(yàn)證，與Roberts等[24]研究結(jié)果一致。

在灌胃乳鐵素后，通過不同時(shí)間段內(nèi)采集的血樣，檢測(cè)細(xì)胞因子IL-4、IL-6、IL-10和TNF-α的變化，可以發(fā)現(xiàn)，牛乳鐵素被攝入后，只是在一定的時(shí)間內(nèi)發(fā)揮作用，有作用的最佳時(shí)間段，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，其作用逐漸減弱(圖5)。攝入后對(duì)免疫細(xì)胞因子分泌的影響，根據(jù)圖6的推演，乳鐵素與樹突細(xì)胞、淋巴細(xì)胞或腸細(xì)胞上的受體結(jié)合，通過表達(dá)MHCⅡ分子，將抗原呈遞給T細(xì)胞，促進(jìn)T細(xì)胞的增殖與分化，形成Th1和Th2細(xì)胞，由Th1細(xì)胞分泌IL-2。通過IL-2刺激巨噬細(xì)胞，產(chǎn)生TNF-α，使其表達(dá)水平升高(圖5)。TNF-α可刺激造血肝細(xì)胞、中性粒細(xì)胞發(fā)揮免疫增強(qiáng)作用(圖7)。為了抑制炎癥因子TNF-α過分表達(dá)，避免造成組織傷害，Th2細(xì)胞分泌IL-10抑制TNF-α的分泌，其抑制關(guān)系參見圖7[25]。從圖4、5可以看出，在灌胃后第3h，IL-10和TNF-α都顯示出高水平的表達(dá)，二者的變化規(guī)律一致，從而說明了圖7所顯示的抑制關(guān)系。

從圖2、3可以看出，乳鐵素對(duì)IL-4和IL-6的產(chǎn)生具有抑制作用。由圖7可知，IL-4和IL-6可通過Th2細(xì)胞產(chǎn)生，也可通過其他細(xì)胞產(chǎn)生。而IL-4和IL-6都具有增強(qiáng)Th2細(xì)胞的作用，Th2細(xì)胞主要分泌抗炎細(xì)胞因子(IL-4、IL-10、IL-13、TGF-β等)抑制Th1、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等細(xì)胞作用，起抗炎作用或抑制免疫的作用。從這一角度分析說明，口服乳鐵素具有增強(qiáng)免疫的作用。

圖7 細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)示意圖Fig.7 Network of immunological cytokines

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Effect of Bovine Lactoferricin on Cytokines

HU Zhi-he，LIU Chuan-guo，LI Na，PANG Guang-chang，CHEN Qing-sen
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

In order to figure out whether bovine lactoferricin (LfcinB) has immuno-regulation function, cytokines such as IL-2, IL-4, IL-6, IL-10 and TNF-α in blood sera from mice orally administered with LfcinB were tested using ELISA kits. The results indicated that IL-2 and TNF-α levels in lactoferricin treatment mice at 3 h post-administration were both even higher (P ≤ 0.01) than those in negative control mice, whereas the levels of anti-inflammatory cytokines, IL-4 (P ≤ 0.01) and IL-6 (P ≤0.05) revealed a significant decrease, and IL-10 level which is positively correlated with TNF-α level and plays a balancing role also changed notably. Therefore, oral administration of lactoferricin has the potential to provide the function of immune enhancement and regulation.

lactoferricin；cytokine；immuno-regulation function

R151.2

A

1002-6630(2010)17-0245-05

2009-12-23

天津市科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(07ZCKFNC00200)

胡志和(1962—)，男，教授，碩士，主要從事專用功能食品研究與開發(fā)。E-mail：hzhihe@tjcu.edu.cn