具有胃黏膜保護(hù)作用的羊肚菌菌株的篩選及其液體發(fā)酵

任 丹，羅 霞，余夢(mèng)瑤，鄭林用，魏 巍,4，姬超宏，葛紹榮,*

(1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610064；2.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川 成都 610041；3.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，四川 成都 610066；4.德陽市食用菌專家大院，四川 德陽 618003)

具有胃黏膜保護(hù)作用的羊肚菌菌株的篩選及其液體發(fā)酵

任 丹1,2，羅 霞2，余夢(mèng)瑤2，鄭林用1,3,4，魏 巍1,2,4，姬超宏1，葛紹榮1,*

(1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610064；2.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川 成都 610041；3.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，四川 成都 610066；4.德陽市食用菌專家大院，四川 德陽 618003)

目的：篩選獲得具有胃黏膜保護(hù)作用且生物量較高的羊肚菌菌株，并優(yōu)化所獲得菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基，篩選獲得對(duì)胃黏膜保護(hù)效果較好的羊肚菌發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳、氮源。方法：將小鼠隨機(jī)分為正常組、模型對(duì)照組和不同給藥劑量組，以無水乙醇誘導(dǎo)胃黏膜損傷為模型，比較各組胃黏膜損傷指數(shù)，同時(shí)測(cè)定并比較不同羊肚菌菌株生物量；利用碳氮源單因素和正交試驗(yàn)，以胃黏膜損傷指數(shù)為主要篩選指標(biāo)，同時(shí)測(cè)定并比較不同培養(yǎng)基發(fā)酵羊肚菌菌株生物量與胞外多糖含量。結(jié)果：羊肚菌M1液體發(fā)酵物的水提液，能顯著降低小鼠急性酒精胃黏膜損傷的損傷指數(shù)(P＜0.05)，同時(shí)生物量達(dá)到10.28g/L；分別以可溶性淀粉與酵母膏為碳、氮源時(shí)M1液體發(fā)酵物的水提液對(duì)小鼠胃黏膜保護(hù)效果最好，抑制率分別達(dá)到80.92%、53.02%；正交試驗(yàn)結(jié)果表明：以質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%可溶性淀粉和1.5%酵母膏組合時(shí)M1液體發(fā)酵物的水提液對(duì)小鼠胃黏膜保護(hù)效果較好，抑制率達(dá)到76.02%，生物量達(dá)到8.88g/L。結(jié)論：羊肚菌M1不僅對(duì)小鼠胃黏膜具有較好的保護(hù)作用，而且生物量較高，其對(duì)胃黏膜保護(hù)效果較好的發(fā)酵培養(yǎng)基中的最適碳、氮源為可溶性淀粉2.0%、酵母膏1.5%。

羊肚菌；無水乙醇；胃黏膜損傷；液體發(fā)酵

羊肚菌隸屬于子囊菌亞門(Ascomycotina)盤菌綱(Discomycetes)盤菌目(Pezizales)羊肚菌科(Morchellaceae)羊肚菌屬(Morchella)[1]。羊肚菌以其菌蓋表面生有許多小凹坑，外觀極似羊肚而得名[2]，是一種野生名貴食(藥)用菌，肉質(zhì)脆嫩可口。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為羊肚菌性平味甘，可入藥，具有益腸消食、化痰理氣、潤(rùn)胃健脾等功效[3]。吳映明等[4-5]研究稱羊肚菌子實(shí)體水溶性提取液具有加強(qiáng)小腸推進(jìn)和促進(jìn)胃排空的功效。中醫(yī)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)關(guān)于羊肚菌對(duì)胃腸道保護(hù)作用的記載及研究?jī)H限于其子實(shí)體，而且目前羊肚菌還不能進(jìn)行規(guī)?；斯ぴ耘?，同時(shí)利用羊肚菌液體發(fā)酵物(菌絲體)的水提液研究其對(duì)胃黏膜的保護(hù)作用還未見報(bào)道。針對(duì)以上問題，本實(shí)驗(yàn)利用液體發(fā)酵技術(shù)，研究其發(fā)酵物水提液對(duì)無水乙醇致小鼠胃黏膜損傷的保護(hù)作用，篩選獲得對(duì)小鼠胃黏膜具有保護(hù)功效的羊肚菌菌株，并優(yōu)化其發(fā)酵培養(yǎng)基，以期為具有養(yǎng)胃功效的羊肚菌新產(chǎn)品的開發(fā)提供工業(yè)化生產(chǎn)的新原料。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

羊肚菌(Morchella spp.)M1～M9由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥細(xì)胞與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離、保存。

PDA改良培養(yǎng)基(組分按質(zhì)量分?jǐn)?shù)配制)：土豆200g、葡萄糖2.0%、蛋白胨0.2%、KH2PO40.15%、MgSO40.05%、瓊脂1.5%。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠(SPF級(jí)，合格證號(hào)：SCXK(川)2005-19)，體質(zhì)量(20±2)g，由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院動(dòng)物所提供。

1.3 試劑

葡萄糖、蛋白胨、無水乙醇 成都市科龍化工試劑廠；MgSO4·7H2O、KH2PO4、35%甲醛溶液 成都化學(xué)試劑廠，以上試劑均為分析純。

1.4 方法

1.4.1 羊肚菌液體發(fā)酵物(菌絲體)水提液(簡(jiǎn)稱羊肚菌水提液)的制備

把分離好的羊肚菌菌株轉(zhuǎn)接到PDA斜面，于27℃培養(yǎng)7d[6]；然后轉(zhuǎn)接到裝有250mL PDA培養(yǎng)液的500mL三角瓶?jī)?nèi)，27℃、150r/min進(jìn)行液體種子培養(yǎng)，培養(yǎng)7d；最后以體積分?jǐn)?shù)10%的接種量轉(zhuǎn)到裝有250mL相同培養(yǎng)基的500mL三角瓶?jī)?nèi)進(jìn)行液體發(fā)酵，在相同條件下培養(yǎng)7d。將發(fā)酵物水提、濃縮(3:1)，即可。

1.4.2 具有胃黏膜保護(hù)作用的羊肚菌菌株篩選及其生物量的測(cè)定

1.4.2.1 羊肚菌水提液對(duì)小鼠胃黏膜保護(hù)損傷指數(shù)測(cè)定

昆明種小鼠，每組10只，雌雄各半，隨機(jī)分組：正常組、模型對(duì)照組和給藥組。給藥組灌胃給予羊肚菌水提液40mL/(kg bw·d)，正常組和模型對(duì)照組灌胃給予同等體積的蒸餾水。小鼠連續(xù)灌胃14d，實(shí)驗(yàn)結(jié)束前一天禁食不禁水24h，第14天正常組和模型對(duì)照組灌胃蒸餾水，給藥組灌胃樣品，30min后，除正常組外各組灌胃無水乙醇10mL/kg bw，1h后頸椎脫臼處死小鼠取胃，用生理鹽水沖洗，然后放入體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液固定30min，沿胃大彎剪開胃，在解剖鏡下觀察胃黏膜損傷情況[7-10]。用Guth等[11]方法計(jì)算損傷指數(shù)：點(diǎn)狀糜爛記為1分，小于lmm記為2分，1～2mm記為3分，3～4mm記為4分，大于4mm記為5分。

1.4.2.2 羊肚菌菌株生物量測(cè)定

將發(fā)酵液過濾，濾液留用，所得菌絲體用蒸餾水反復(fù)洗滌，置于80℃干燥箱中烘干至質(zhì)量恒定，按文獻(xiàn)[12]方法測(cè)定生物量。

1.4.3 碳、氮源的單因素篩選試驗(yàn)

1.4.3.1 碳源篩選試驗(yàn)

在PDA培養(yǎng)基中分別以蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、玉米粉、麥芽糖和乳糖代替土豆和葡萄糖作為碳源，碳源質(zhì)量分?jǐn)?shù)都為2.0%，其他成分和條件與PDA培養(yǎng)基相同，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。然后對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行胃黏膜損傷指數(shù)、生物量、胞外多糖含量的測(cè)定。

1.4.3.2 氮源篩選試驗(yàn)

在PDA培養(yǎng)基中分別以牛肉膏、酵母膏、黃豆粉、硫酸銨和麥麩代替蛋白胨作為氮源，麥麩需煮沸取汁，氮源質(zhì)量分?jǐn)?shù)都為0.2%，其他成分和條件與PDA培養(yǎng)基相同，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。然后對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行胃黏膜損傷指數(shù)、生物量、胞外多糖含量的測(cè)定。

1.4.4 碳、氮源正交試驗(yàn)

在碳、氮源的單因素篩選試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以胃黏膜損傷指數(shù)、生物量、胞外多糖含量為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)，發(fā)酵條件與上述相同，設(shè)3個(gè)重復(fù)[13-14]，因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 碳、氮源正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 1 Factors and levels in the complete combination design

1.5 胞外多糖含量測(cè)定

準(zhǔn)確量取2mL過濾所得的濾液，5000r/min離心10min，取上清液加3倍體積的無水乙醇，置冰箱中24h后，再于5000r/min離心10min，棄去上清液，取沉淀溶于一定量去離子水中稀釋，用硫酸-蒽酮法[15]測(cè)定胞外多糖含量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel處理數(shù)據(jù)，胃黏膜損傷指數(shù)用x±s表示，數(shù)據(jù)比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 具有胃黏膜保護(hù)作用的羊肚菌菌株篩選及其生物量的比較

表2 不同處理的羊肚菌水提液對(duì)小鼠胃黏膜損傷的影響Table 2 Amounts of biomass of different Morchellas spp. strains and protective effects of their water extracts against gastric mucosa lesion

無水乙醇所致小鼠胃黏膜損傷，多呈點(diǎn)狀或條索狀，多在腺胃部發(fā)生。從表2可以看出，M1、M2和M3給藥組胃黏膜損傷指數(shù)顯著低于模型對(duì)照組(P＜ 0.05)，其抑制率分別達(dá)到了83.94%、74.06%和90.12%；M4～M9損傷指數(shù)雖然低于模型對(duì)照組，但是與模型對(duì)照組比較無顯著差異(P＞0.05)。從表2還可以看出，M1菌株的生物量最大，達(dá)到了10.28g/L，其次是M4，也達(dá)到了9.79g/L。M5菌株的生物量最低，僅有7.73g/L。綜合考慮，認(rèn)為羊肚菌M1對(duì)胃黏膜保護(hù)作用較好同時(shí)生物量較高，因此選擇羊肚菌M1作為下一步研究的出發(fā)菌株。

2.2 不同碳源發(fā)酵M1的水提液對(duì)胃黏膜的保護(hù)作用

表3 不同碳源發(fā)酵M1的水提液對(duì)胃黏膜的保護(hù)作用Table 3 Effect of carbon source type on the inhibition rate of the water extract from strain M1 against grastric mucosa lesion, its biomass and extracellular polysaccharide production

從表3可以看出，以蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、玉米粉和麥芽糖作為碳源時(shí)，其所培養(yǎng)的M1的水提液對(duì)小鼠胃黏膜的損傷指數(shù)與模型對(duì)照組相比，均具有極顯著差異(P＜0.01)，說明對(duì)小鼠胃黏膜具有保護(hù)性作用；以乳糖為碳源培養(yǎng)的M1水提液對(duì)小鼠胃黏膜損傷指數(shù)與模型對(duì)照組相比，沒有顯著性差異(P＞0.05)，對(duì)胃黏膜沒有保護(hù)作用。

從表3還可以看出，羊肚菌在這6種碳源中都可以生長(zhǎng)，其中麥芽糖為其生長(zhǎng)最適的碳源，生物量達(dá)到6.87g/L；其次為可溶性淀粉和葡萄糖，生物量分別為6.53g/L和5.73g/L。乳糖為碳源時(shí)，生物量最低，僅有3.42g/L。

不同碳源對(duì)M1胞外多糖的影響表明，以葡萄糖為碳源時(shí)的胞外多糖含量最高，達(dá)到2.712mg/mL，蔗糖最小，僅有1.050mg/mL，其大小順序?yàn)椋浩咸烟牵究扇苄缘矸郏救樘牵居衩追郏钧溠刻牵菊崽恰?/p>

綜合考慮，以可溶性淀粉為碳源時(shí)，其發(fā)酵的M1的水提液對(duì)胃黏膜保護(hù)效果最好，且生物量和胞外多糖含量較高，選擇可溶性淀粉為M1液體發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源。

2.3 不同氮源發(fā)酵M1的水提液對(duì)胃黏膜的保護(hù)作用

從表4可以看出，以牛肉膏、酵母膏和硫酸銨作為氮源時(shí)，其所培養(yǎng)的M1的水提液對(duì)小鼠胃黏膜損傷指數(shù)與模型對(duì)照組相比，均具有顯著差異(P＜0.05)，說

明對(duì)小鼠胃黏膜具有預(yù)防性保護(hù)作用；以黃豆粉和麥麩為氮源培養(yǎng)的M1的水提液對(duì)小鼠胃黏膜損傷指數(shù)與模型對(duì)照組相比，沒有顯著性差異(P＞0.05)，對(duì)胃黏膜沒有保護(hù)作用。

表4 不同氮源發(fā)酵M1的水提液對(duì)胃黏膜的保護(hù)作用Table 4 Effect of nitrogen source type on the inhibition rate of the water extract from strain M1 against grastric mucosa lesion, its biomass and extracellular polysaccharide production

從表4還可以看出，5種氮源均能作為羊肚菌M1的培養(yǎng)基中的氮源，其中以牛肉膏、黃豆粉、酵母膏作為氮源時(shí)，其生物量較高，分別為11.44、12.59、11.35g/L；麥麩最低，只有6.78g/L。

不同氮源對(duì)M1胞外多糖的影響表明，以硫酸銨為氮源時(shí)的胞外多糖含量最高，達(dá)到3.313mg/mL，其次為酵母膏，麥麩最小。

綜合考慮，以酵母膏為氮源時(shí)，其發(fā)酵的M1的水提液對(duì)胃黏膜保護(hù)效果最好，且生物量和胞外多糖含量較高，選擇酵母膏為M1液體發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源。

2.4 碳、氮源正交試驗(yàn)結(jié)果

表5 碳、氮源正交試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Complete combination design matrix and experimental results

從表5可以看出，除A1B1組合外，其余8個(gè)組合所發(fā)酵出的羊肚菌M1的菌絲體水提物均對(duì)酒精引起的小鼠急性胃黏膜損傷具有保護(hù)作用，與模型對(duì)照組比較有顯著差異(P＜0.05)，其中A2B3、A3B3、A1B3、A2B2、A3B1組合對(duì)胃黏膜損傷抑制率較高，分別為81.74%、76.02%、75.81%、73.43%、71.93%，說明這5個(gè)組合對(duì)酒精引起的小鼠急性胃黏膜損傷的保護(hù)作用較好。

同時(shí)，由極差分析可知，對(duì)損傷指數(shù)而言，影響大小依次為氮源＞碳源，說明氮源對(duì)胃黏膜損傷的影響較大；對(duì)生物量、胞外多糖而言，影響大小依次均為碳源＞氮源，說明碳源對(duì)發(fā)酵的生物量、胞外多糖影響較大。

綜合考慮，由于以胃黏膜保護(hù)功效為主要篩選指標(biāo)，因此，選擇A2B3和A3B3。但由于A3B3的生物量和胞外多糖含量要明顯高于A2B3，有利于其進(jìn)行液體發(fā)酵，所以確定最佳碳、氮源組合為A3B3，即可溶性淀粉2.0%，酵母膏1.5%。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)以無水乙醇致小鼠胃黏膜損傷為模型，研究不同羊肚菌的水提液對(duì)胃黏膜的保護(hù)效果，同時(shí)研究了不同羊肚菌菌株在相同PDA培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況，篩選獲得了對(duì)小鼠胃黏膜具有保護(hù)功效和生物量較高的羊肚菌菌株M1。結(jié)果表明，不同羊肚菌菌株其發(fā)酵物水提液對(duì)胃黏膜的保護(hù)效果差異顯著，可能由于菌株本身之間存在較大差異，導(dǎo)致其代謝產(chǎn)物和藥用成分存在較大差異。同時(shí)不同羊肚菌菌株在相同PDA培養(yǎng)基中生物量差異也較大，這可能是因?yàn)椴煌N的羊肚菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)條件和環(huán)境條件的要求是不同的。

已有文獻(xiàn)報(bào)道[16-19]不同碳、氮源對(duì)羊肚菌菌株液體發(fā)酵的生物量和胞外多糖的影響，而以藥效為主要指標(biāo)進(jìn)行羊肚菌發(fā)酵培養(yǎng)基中碳、氮源的研究，目前尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以胃黏膜保護(hù)功效為主要指標(biāo)，進(jìn)行羊肚菌發(fā)酵培養(yǎng)基中碳、氮源的研究。碳、氮源單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，以可溶性淀粉為碳源時(shí)，其發(fā)酵的M1的水提液對(duì)胃黏膜保護(hù)效果最好，且M1的生物量較高，可能由于可溶性淀粉含有多種酶，利于可溶性淀粉和其他成分的降解，使M1充分吸收，產(chǎn)生較多的次生代謝產(chǎn)物和活性物質(zhì)；以酵母膏為氮源時(shí)，其發(fā)酵的M1的水提液對(duì)胃黏膜保護(hù)效果最好，且M1的生物量較高，可能由于酵母膏是復(fù)合氮源，含有多種營(yíng)養(yǎng)因子，利于M1的生長(zhǎng)和代謝，產(chǎn)生多種活性成分，起到對(duì)胃黏膜保護(hù)的作用。同時(shí)還表明，不同碳源對(duì)M1胞外多糖的影響較大，其中以葡萄糖為碳源時(shí)，其含量最大。引起這種差異的主要原因可能是該菌對(duì)不同糖類底物的利用率有較大差異。以果糖等物質(zhì)為碳源時(shí)，胞外多

糖合成過程中需要一些活性酶的參與，這樣限制了以果糖等糖類為碳源合成胞外多糖。而利用葡萄糖為碳源在胞外多糖合成過程中卻不需要這些酶[20]。另外，這些碳源中葡萄糖是單糖，可直接被菌體吸收，而其他的是二糖或多糖，必須先變成單糖才能被菌體利用，故以葡萄糖作為碳源的菌體生長(zhǎng)速度快[21]。這樣可能會(huì)使以葡萄糖為碳源培養(yǎng)的M1在相同的發(fā)酵時(shí)間內(nèi)比其他碳源培養(yǎng)的M1，代謝較充分，產(chǎn)生較多的多糖、多肽、生物堿等生理活性物質(zhì)。本研究M1液體發(fā)酵物水提液中具體的對(duì)小鼠胃黏膜保護(hù)的活性物質(zhì)及作用機(jī)理，還有待進(jìn)一步深入的研究。

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Screening and Liquid-state Fermentation of Morchellas spp. Strain Having Gastricprotective Effect

REN Dan1,2，LUO Xia2，YU Meng-yao2，ZHENG Lin-yong1,3,4，WEI Wei1,2,4，JI Chao-hong1，GE Shao-rong1,*
(1. Key Laboratory of Bio-resources and Eco-environment, Ministry of Education, School of Life Science, Sichuan University, Chengdu 610064, China；2. Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences, Chengdu 610041, China；3. Soil and Fertilizer Institute, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Chengdu 610066, China；4. Edible and Medicinal Fungi Expert Society in Deyang, Deyang 618003, China)

Objective: To screen a Morchellas spp. strain having gastricprotective effect and higher biomass from 9 strains, and to optimize carbon and nitrogen sources for cultivation of the screened Morchellas spp. strain. Methods: Mice were randomly divided into normal group, control group and different dose administration groups. An experimental gastric damage model was established by ethanol intragastric infusion. On the basis of selection of the optimum carbon and nitrogen sources, their optimum amounts were optimized by complete combination experiments involving three levels for achieving an optimum compromise among low lesion index and high biomass and extracellular polysaccharide production. Results: The water extract of strain M1 could significantly reduce the injury index of acute gastric mucosa lesion in ethanol-induced mice and the amount of biomass was up to 10.28 g/L. In addition, the extract exhibited the best gastricprotective effect and provided inhibition rates up to 80.92% and 53.02% against gastric mucosa damage when the carbon and nitrogen sources were soluble starch and yeast extract during liquidstate fermentation. Better gastricprotective effect and higher biomass production could simultaneously be achieved by using 2.0% soluble starch as carbon source and 1.5% yeast extract as nitrogen source. As a result, the inhibition rate against grastric mucosa lesion was 76.02% and the biomass was 8.88 g/L. Conclusion: Strain M1 has the potential to protect against gastric

Morchella escutenta；ethanol；gastric mucosa lesion；liquid-state fermentation

TQ920.1

A

1002-6630(2010)17-0240-05

2009-12-29

國家農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)；四川省科技條件平臺(tái)項(xiàng)目

任丹(1984—)，男，碩士研究生，主要從事食藥用真菌研究。E-mail：rd7534@163.com

*通信作者：葛紹榮(1950—)，男，副教授，本科，主要從事微生物的分類鑒定與應(yīng)用研究。E-mail：shaorong50@163.com

mucosa lesion, and higher biomass during liquid-state fermentation can be achieved by using 2.0% soluble starch as carbon source and 1.5% yeast extract as nitrogen source.