白芨多糖BSPI-A的分離純化及結(jié)構(gòu)研究

王 博，徐 莎，黃琳娟，王仲孚*

(西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西部資源生物與現(xiàn)代生物技術(shù)省部共建教育部重點實驗室，陜西省生物技術(shù)重點實驗室，陜西 西安 710069)

白芨多糖BSPI-A的分離純化及結(jié)構(gòu)研究

王 博，徐 莎，黃琳娟，王仲孚*

(西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西部資源生物與現(xiàn)代生物技術(shù)省部共建教育部重點實驗室，陜西省生物技術(shù)重點實驗室，陜西 西安 710069)

從白芨[Bletilla striata (Thunb.) Reichb.f.]塊莖中提取出粗多糖(crude Bletilla striata polysaccharide，CBSP)，然后經(jīng)DEAE-cellulose柱層析分離得到BSPI、BSPII兩個多糖組分。BSPI過Bio-Gel P-300柱層析純化后得到組分BSPI-A。高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)測得BSPI-A的分子質(zhì)量大于4.0×105D。經(jīng)IR、GC、GC-MS、甲基化等方法對該多糖的結(jié)構(gòu)進行表征。結(jié)果表明：BSPI-A為直鏈多糖，主要由β(1,4)甘露糖和β(1,4)葡萄糖組成，其物質(zhì)的量比為8.09:1。

白芨；多糖；分離純化；結(jié)構(gòu)解析

白芨[1][Bletilla striata (Thunb.) Reichb. f .]是蘭科白芨屬，多年生草本植物，有收斂止血、清熱利濕、消腫生肌之功效。其藥用成分為富含的白芨膠質(zhì), 主要由大分子多糖組成。白芨多糖膠具有特殊的黏度特性，其理化性質(zhì)與阿拉伯膠、西黃耆膠類似，可廣泛應(yīng)用于食品[2]、醫(yī)藥[3-4]、化妝[5]等各領(lǐng)域。據(jù)文獻[6]報道，白芨多糖的化學(xué)組成為葡萄甘露聚糖，但目前對其精確結(jié)構(gòu)尚未闡明。因此，本實驗以白芨塊莖為研究對象，提取其中的多糖成分，利用離子交換柱層析及凝膠柱層析進行分離純化，得到了多糖組分BSPI-A，并對其理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)進行較為系統(tǒng)的研究，旨在為白芨膠多糖的進一步開發(fā)與利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白芨[Bletilla striata (Thunb.) Reichb. f .]購于西安市萬壽路中藥材批發(fā)市場，經(jīng)鑒定為蘭科白芨屬白芨的塊莖。

鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖(分析純) 上海國藥集團；葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、藍色葡聚糖、雞蛋白蛋白、二甲基亞砜(DMSO)(分析純) Sigma公司；碘甲烷(分析純)北京化學(xué)試劑公司；DOWEX 50WX8-200離子交換樹脂

Aldrich公司；DEAE-纖維素 上海恒信化學(xué)試劑有限公司；Bio-Gel P-300 Bio-Rad公司；葡聚糖分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品(優(yōu)級純) Fluka公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters 2695型高效液相色譜儀(配置2414示差折光檢測器) 美國Waters公司；Shimadzu GC2010型氣相色譜儀(采用FID檢測器)、Shimadzu GC-MS-QP2010型氣質(zhì)聯(lián)用儀(采用電子轟擊(EI)離子源) 日本Shimadzu公司；Perkin Elmer Lambda 25 UV-VIS型紫外分光光度計美國Perkin Elmer公司；Bruker EQUINOX 55型傅里葉紅外光譜儀 德國Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 BSPI-A的分離與純化[7]

白芨塊莖烘干(50℃)，粉碎后過篩，70℃熱水提取4h，提取過程中以1mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至中性。將提取液10000r/min離心10min，殘渣用70℃熱水重復(fù)提取4h，合并兩次提取液，濃縮，乙醇沉淀，加Sevag試劑(二氯甲烷與正丁醇的體積比為4:1)除去游離蛋白質(zhì)，透析，冷凍干燥，得到棕色白芨粗多糖CBSP。

CBSP過DEAE-Cellulose柱(HCO3－型)，依次用蒸餾水和0.05、0.10、0.25、0.50mol/L NaHCO3溶液梯度洗脫，隔管檢測A490nm(苯酚-硫酸法)，合并單一峰，由蒸餾水和0.05mol/L NaHCO3溶液洗脫得到BSPI、BSPII兩個多糖組分。BSPI經(jīng)Bio-Gel P-300凝膠柱色譜純化，以0.1mol/L NaCl溶液等度洗脫，得到純化的白色絮狀多糖BSPI-A。

1.3.2 糖含量與蛋白質(zhì)含量測定

糖含量和蛋白質(zhì)含量的測定依據(jù)苯酚-硫酸法[8-9]和Bradford法[10]進行。分別以葡萄糖和雞蛋白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品糖與蛋白質(zhì)含量。

1.3.3 BSPI-A的純度與分子質(zhì)量測定

采用高效凝膠滲透色譜法[11-13](HPGPC)對BSPI-A進行純度及分子質(zhì)量測定。色譜條件為：TSK-Gel G4000SW色譜柱(7.5mm×300mm)，流動相為磷酸鹽緩沖液(0.02mol/L，pH6.0)，標(biāo)準(zhǔn)品及樣品質(zhì)量濃度均為2mg/mL)，進樣量20μL，流速0.5mL/min，柱箱溫度和檢測器溫度均為30℃。

先將Dextran標(biāo)準(zhǔn)品5.2、11.6、25、48.6、80kD和164kD按分子質(zhì)量由小到大順序依次進樣，然后對樣品進樣，測定保留時間。以lgMw(分子質(zhì)量對數(shù))對tR(保留時間)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)線性回歸方程計算樣品的相對分子質(zhì)量。

1.3.4 BSPI-A的單糖組成分析

取2mg樣品，加入2mL 2mol/L TFA，密閉，121℃水解2h，減壓抽干。按照Lehrfeld[14]的方法通過氣相色譜同時檢測中性糖和糖醛酸[12]。色譜柱為rtx-50柱(30.0m× 0.25mm，0.25μm)。程序升溫條件為：180℃(2min)→6℃/min，210℃→0.3℃/min，215℃→6℃/min，240℃(30min)。

1.3.5 BSPI-A的紫外(UV)光譜和紅外(IR) 光譜分析

將樣品溶于水，質(zhì)量濃度為10mg/mL，于波長200～400nm之間進行紫外掃描。紅外光譜檢測時，樣品用KBr壓片，于4000～400cm-1范圍內(nèi)進行掃描。

1.3.6 BSPI-A的甲基化分析[15]

由于BSPI-A難溶于DMSO，故先將其乙?；?吡啶-乙酸酐)[16]，然后甲基化采用Needs等[17]的方法。甲基化樣品經(jīng)水解、還原、乙?；苽洳糠旨谆奶谴家阴ｕパ苌?，進行GC與GC-MS分析。GC-MS色譜柱為rtx-5ms柱(30.0m×0.25mm，0.25μm)，程序升溫條件：140℃(2min)→150℃(0.2℃/min)→240℃(12℃/ min，10min)。

2 結(jié)果與分析

2.1 BSPI-A的分離純化

圖1 CBSP經(jīng)DEAE-纖維素柱(30cm×5cm)色譜的分離圖Fig.1 Elution profile of CBSP on DEAE-cellulose column (30 cm×5 cm)

圖2 BSPI經(jīng)Bio-Gel P-300柱(110cm×1.7cm)色譜的分離圖Fig.2 Elution profile of BSPI on Bio-Gel P-300 column (110 cm× 1.7 cm)

經(jīng)熱水提取、醇沉、Sevag法脫蛋白、透析得白

芨粗多糖(CBSP)，得率為16.20%。粗多糖呈棕色蓬松狀，水溶液黏度較大。CBSP經(jīng)DEAE-cellulose柱層析分離得到BSPI、BSPII兩個組分，結(jié)果如圖1所示。BSPI經(jīng)Bio-Gel P-300柱純化，收集20～48管，結(jié)果如圖2所示，然后再經(jīng)Bio-Gel P-300進一步純化，得到組分BSPI-A，結(jié)果如圖3所示。

圖3 22～48管經(jīng)Bio-Gel P-300柱(110cm×1.7cm)色譜的分離圖Fig.3 Elution profile of pooled fractions 22 through 48 (shown in Fig. 2) on Bio-Gel P-300 column (110 cm×1.7 cm)

2.2 糖含量與蛋白含量測定

苯酚-硫酸法測得CBSP、BSPI-A的糖含量分別為76.52%、92.31%。依據(jù)Bradford法測得CBSP的蛋白含量為0.11%。

2.3 BSPI-A純度及分子質(zhì)量測定

圖4 BSPI-A的HPGPC圖Fig.4 HPGPC profile of BSPI-A on TSK-Gel G4000SW column

均一性及分子質(zhì)量測定采用高效凝膠滲透色譜法(HPGCP)進行分析，色譜柱為TSK-Gel G4000SW柱。將系列葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品 5.2、11.6、25、48.6、80kD和164kD分別用磷酸鹽緩沖液(0.02mol/L，pH6.0)配成質(zhì)量濃度為2mg/mL的溶液，測定保留時間。根據(jù)保留時間及分子質(zhì)量對數(shù)，得到線性回歸方程：lgMw=7.12996－0.11596tR，R=0.9996。

BSPI-A在HPLC上的保留時間為13.1220min(圖4)，已超過線性范圍，其被凝膠柱排阻，故其分子質(zhì)量大于4.0×105D。

2.4 BSPI-A單糖組成分析

樣品經(jīng)2mol/L TFA水解后，按1.3.4節(jié)的方法進行衍生，然后進行氣相色譜分析。標(biāo)準(zhǔn)單糖混合物按同樣的方法進行衍生并進行GC分析。將樣品的圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜進行對照，根據(jù)保留時間推斷其衍生物類型。標(biāo)準(zhǔn)單糖混合物的氣相色譜圖如圖5A所示。

圖5 BSPI-A的糖醇乙酸酯衍生物的氣相色譜圖Fig.5 Gas chromatograms of alditol acetate derivatives of BSPI-A (A, mixed monosaccharide standards; B, BSPI-A)

樣品按1.3.4節(jié)方法衍生后，進行氣相色譜(GC)分析，結(jié)果如圖5B所示。BSPI-A由甘露糖和葡萄糖組成，其物質(zhì)的量比為8.09:1。

2.5 BSPI-A的紫外(UV)光譜和紅外(IR)光譜檢測

紫外分析結(jié)果表明：BSPI-A在波長260nm和280nm處均無明顯吸收，說明該多糖不含糖蛋白、多肽和核酸。這與比色法測定蛋白含量的結(jié)果一致。

紅外光譜中，BSPI-A有多糖特征吸收峰，3600～3200cm-1處的吸收峰為O－H的伸縮振動；2925cm-1處有中強吸收，表示有糖類－CH2或－CH3的C－H伸縮振動；877cm-1處有弱吸收，表明有β-D-型葡萄吡喃糖與β-D-型甘露吡喃糖存在；未顯示有羧基的存在，這與氣相色譜的結(jié)果一致。

2.6 BSPI-A甲基化分析

BSPI-A經(jīng)乙酰化處理，然后甲基化3次，得到完全甲基化的多糖。經(jīng)酸水解、還原及乙?；?，生成部分甲基化的糖醇乙酸酯衍生物，對其進行GC與GC-MS

分析，總離子流圖(TIC)如圖6所示, 色譜分析柱為rtx-50ms，質(zhì)譜電離方式為EI源。

圖6 BSPI-A部分甲基化糖醇乙酸酯的TIC圖Fig.6 TIC chromatogram of partially methylated alditol acetates of BSPI-A

圖6 中1～3號峰相應(yīng)的質(zhì)譜圖如圖7A～C所示。

圖7 BSPI-A部分甲基化糖醇乙酸酯的質(zhì)譜圖Fig.7 Mass spectra of partially methylated alditol acetates of BSPI-A

表1 BSPI-A的甲基化分析結(jié)果Table 1 Methylation analysis of BSPI-A

結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)圖譜及GC分析結(jié)果對圖6中各峰分別進行歸屬，并計算該連接方式占總連接方式的相對物質(zhì)的量比[18-19]，如表1所示。

由表1可見，BSPI-A為直鏈多糖，甲基化的BSPI-A中-4)Man(1-含量很高，占總糖量的89.2%，Man與Glc相對物質(zhì)的量比約為8.09:1，這與糖組成分析結(jié)果一致。Man的糖環(huán)構(gòu)型為吡喃型，這與紅外光譜所得結(jié)果一致。糖鏈的非還原末端由Glc構(gòu)成，占總糖量的2.43%。

3 結(jié) 論

本研究通過一系列的分離純化方法從白芨塊莖中提取到一種多糖BSPI-A，并對其理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)進行了較為系統(tǒng)的研究。BSPI-A是一種直鏈多糖，分子質(zhì)量大于4.0× 105D，主要由甘露糖和葡萄糖組成，其物質(zhì)的量比為8.09:1，連接方式為1,4-連接。由于BSPI-A中含有豐富的鄰位順式羥基，如甘露糖中的C2、C3羥基，這些羥基可與絡(luò)合劑中的過渡金屬離子交聯(lián)形成高黏彈性凍膠[20]，具有特殊的物理、化學(xué)性能，從而具有廣泛的應(yīng)用前景。

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Isolation, Purification and Structural Characterization of a Polysaccharide Fraction from Stem Tuber of Bletilla striata, Named BSPI-A

WANG Bo，XU Sha，HUANG Lin-juan，WANG Zhong-fu*
(Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Western China, Ministry of Ed,ucation, Shaanxi Provincial Key Laboratory of Biotechnology, College of Life Science, Northwest University, Xi an 710069, China)

The crude polysaccharide extract, named CBSP, from the stem tubers of Bletilla striata was purified/fractionated by DEAE-cellulose column chromatography, and two fractions were obtained and they were named BSPI and BSPII. BSPI was further purified by Bio-Gel P-300 column chromatography, and a sub-fraction was obtained and it was named BSPI-A. HPGPC analysis showed that the molecular weigh of BSPI-A was more than 4.0 × 105D. By means of IR spectroscopy, gas chromatography (GC), GC coupled to mass spectrometry (GC-MS) and methylation analysis, the polysaccharide fraction was characterized structurally, and the results indicated that BSPI-A was a linear polysaccharide and that the backbone was composed of 1,4-linked mannose (Man) and 1,4-linked glucose (Glc), with a molar ratio of 8.09:1.

Bletilla striata；polysaccharide；isolation and purification；structural characterization

O629.12

A

1002-6630(2010)17-0120-04

2009-12-25

“十一五”國家科技支撐計劃項目(2006BAD06B00)；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計劃項目(NCET-08-0893)；陜西省科技研究發(fā)展計劃項目 [2007K16-06(3)]

王博(1986—)，男，碩士研究生，研究方向為植物多糖的分離提取與結(jié)構(gòu)解析。E-mail：wangbo12399@126.com

*通信作者：王仲孚(1971—)，男，教授，博士，研究方向為糖生物學(xué)與糖工程學(xué)。E-mail：wangzhf@nwu.edu.cn