蕎麥麩皮提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響

李艷琴，周鳳超，陜 方，邊俊生，王耀文，夏 楠

(1.山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品綜合利用研究所，山西 太原 030006)

蕎麥麩皮提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響

李艷琴1，周鳳超1，陜 方2，邊俊生2，王耀文1，夏 楠1

(1.山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品綜合利用研究所，山西 太原 030006)

本實(shí)驗(yàn)分別用乙醇和水從蕎麥麩皮中提取到了以蕎麥黃酮為主要成分的乙醇粗提物和以蕎麥糖醇為主要成分的水粗提物，并將乙醇粗提物經(jīng)高壓水解，獲得乙醇粗提物的水解物。研究這3種提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響，并以阿卡波糖和D-手性肌醇為參照。比色法和液相色譜法測(cè)得，苦蕎麩皮乙醇粗提物的主要成分為苦蕎黃酮，黃酮含量為74.0%，其中86.5%為蘆丁，槲皮素和異槲皮素微量；乙醇粗提物經(jīng)高壓水解后，總黃酮含量為76.2%，其中，蘆丁、槲皮素和異槲皮素分別占60.6%、25.2%、13.5%。甜蕎麩皮水粗提物的主要成分為D-手性肌醇、肌醇，其含量分別為43.6%、2.9%。3種蕎麥麩皮提取物均具有抑制α-葡萄糖苷酶的活性，作用強(qiáng)度分別為：乙醇粗提物的水解物＞乙醇粗提物＞水粗提物， IC50分別為0.0085、0.0578、17.3551g/L。苦蕎黃酮經(jīng)高壓水解后，抑制α-葡萄糖苷酶活性顯著提高，與阿卡波糖IC50(0.0335g/L)相比，約是它的1/4；水粗提物在低質(zhì)量濃度下抑制效果不明顯，在較高的質(zhì)量濃度下則表現(xiàn)出抑制活性。

蕎麥提取物；α-葡萄糖苷酶；抑制劑；糖尿病

蕎麥?zhǔn)且环N藥食同源的蓼科(Polygobaceae)作物，含有多種降糖、降脂、降血壓等藥用成分，是一種值得加快開發(fā)利用的功能食品[1-2]?？嗍w(Fagopyrum tataricum(L.)Gaertn)和甜蕎(Fagopyrum esculentum

Moench)分別是蕎麥屬的兩個(gè)栽培種?？嗍w麩皮中含有大量的黃酮類化合物，它是一類α-葡萄糖苷酶抑制劑，能有效預(yù)防糖尿病發(fā)生、降低血糖水平[3-4]、減緩糖尿病的發(fā)展和減輕糖尿病并發(fā)癥[5-7]。甜蕎麩皮中糖醇類物質(zhì)豐富，可在人體腸道微生物的作用下降解為D-手性肌醇，提高胰島素受體敏感性、改善胰島素抵抗，從而降低人體中的血脂、血糖[8]。

α-葡萄糖苷酶位于小腸刷狀細(xì)胞表面，是水解多糖為單糖的關(guān)鍵酶[9]，因此α-葡萄糖苷酶抑制劑類藥物能通過降低α-葡萄糖苷酶的活性、調(diào)節(jié)餐后胃腸激素[10-11]而有效控制餐后血糖的升高。目前市場(chǎng)上較為常見的此類藥物為拜耳公司的阿卡波糖(拜糖平)。近年來，糖尿病的患病率急劇上升。有關(guān)專家預(yù)測(cè)，2025年全球糖尿病患者可達(dá)3億[12]。因此，開發(fā)預(yù)防糖尿病發(fā)生的功能食品和高效、無毒副作用的降糖藥物，具有廣泛的應(yīng)用前景。

本實(shí)驗(yàn)測(cè)定蕎麥麩皮提取物的主要成分，研究它們對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制能力，并與拜糖平片進(jìn)行比較，篩選功效較高的藥物成分。旨在為發(fā)展蕎麥的深加工技術(shù)，促進(jìn)糖尿病藥物的開發(fā)與應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

蕎麥麩皮粗提物及其水解物由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品綜合利用研究所提供。

α-葡萄糖苷酶、D-手性肌醇 美國(guó)Sigma公司；pNP-α-Glu(4-nitrophenyl-α-D-glucopyranosodide) 中國(guó)上海Seebio公司；還原性谷胱甘肽(L-Glutathione reduced) 中國(guó)北京Solarbio公司；拜糖平(Glucobay，每片含阿卡波糖50mg) 德國(guó)拜耳公司。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

日立U-2010紫外差譜儀 日本Hitachi Instruments公司；720型 Inolab pH計(jì) 德國(guó)WTW公司； 9005型水浴鍋 美國(guó)PolyScience公司；1525型高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司。

1.2 方法

1.2.1 α-葡萄糖苷酶活性的測(cè)定

阿卡波糖存儲(chǔ)液：取拜糖平1片，溶于超純水中，定容于10mL容量瓶中，超濾膜過濾，阿卡波糖質(zhì)量濃度為5g/L。

α-葡萄糖苷酶活性的測(cè)定：采用1mL反應(yīng)體系；將濃度為4×10-3mol/L 的75μL底物pNPG(用pH 6.8的0.1mol/L磷酸鉀緩沖液配制)、濃度為3.25×10-3mol/L的25μL還原性谷胱甘肽(用pH 6.8的0.1mol/L磷酸鉀緩沖液配制)、一定量的抑制劑(提取物存儲(chǔ)液或阿卡波糖存儲(chǔ)液)依次加入到10mL小試管中，用緩沖液補(bǔ)加至900 μL。于37℃水浴10min，然后迅速加入濃度為1.06×10-6mol/L的100μL α-葡萄糖苷酶溶液(用pH 6.8的0.1mol/L磷酸鉀緩沖液配制)，37℃水浴，精確計(jì)時(shí)10min，期間不斷搖晃。計(jì)時(shí)完畢，迅速加入0.1mol/L的Na2CO3溶液5mL以終止反應(yīng)，而后掃描并記錄A410nm值，以蒸餾水代替酶液為空白對(duì)照。

式中：AE為不加抑制劑的吸光度；AI為加入抑制劑的吸光度。

1.2.2 蕎麥麩皮粗提物主要成分及含量測(cè)定

總黃酮含量測(cè)定采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[13]；蘆丁、槲皮素和異槲皮素含量測(cè)定采用HPLC法[14]；糖醇含量測(cè)定采用HPLC法[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎麩皮乙醇粗提物和水解物的主要成分及含量

比色法、高效液相色譜法測(cè)得苦蕎麩皮乙醇粗提物的主要成分為苦蕎黃酮，總黃酮含量為74.0%，其中86.5%是蘆丁，槲皮素和異槲皮素微量；乙醇粗提物經(jīng)2.0MPa高壓水解后，總黃酮含量為76.2%，其中，蘆丁、槲皮素和異槲皮素分別占60.6%、25.2%、13.5%。

2.2 甜蕎麩皮水粗提物的主要成分及含量

高效液相色譜法測(cè)得甜蕎麩皮水粗提物的主要成分為D-手性肌醇、肌醇，其含量分別為43.6%、2.9%。

2.3 α-葡萄糖苷酶酶促反應(yīng)條件的確定

2.3.1 反應(yīng)時(shí)間的確定

在酶促反應(yīng)中，酶活力用單位時(shí)間內(nèi)酶催化反應(yīng)所得的產(chǎn)物濃度即反應(yīng)速度來表示。在反應(yīng)的初期，產(chǎn)物濃度與反應(yīng)時(shí)間成正比的線性關(guān)系，這個(gè)階段測(cè)定的酶活力最準(zhǔn)確；隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，底物濃度的降低、產(chǎn)物濃度的升高等各種因素干擾了酶促反應(yīng)，所以，酶活力測(cè)定應(yīng)以反應(yīng)的初速度表示。本實(shí)驗(yàn)中，產(chǎn)物在波長(zhǎng)410nm處的吸光度與產(chǎn)物濃度成正比，因而以A410nm值與反應(yīng)時(shí)間作圖，確定酶活力測(cè)定的反應(yīng)時(shí)間，結(jié)果見圖1。

圖1 反應(yīng)時(shí)間與反應(yīng)速度的關(guān)系Fig.1 Relationship between reaction time and reaction rate

從圖1可以看出，在反應(yīng)10min之內(nèi)，產(chǎn)物濃度與反應(yīng)時(shí)間為線性關(guān)系。因此，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，以10min為酶活力測(cè)定反應(yīng)時(shí)間。

2.3.2 底物濃度的確定

酶促反應(yīng)體系中，底物濃度影響酶促反應(yīng)速度是一個(gè)復(fù)雜的過程。當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)，反應(yīng)速度與底物濃度的關(guān)系成正比，隨著底物濃度的增加，反應(yīng)速度趨向一個(gè)極限，即反應(yīng)速度達(dá)到最大值，這時(shí)酶被過量的底物所飽和，即底物濃度不再影響反應(yīng)速度的測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)分別以1×10-5、2×10-5、4×10-5、6× 10-5、 8×10-5mol/L為底物濃度，測(cè)定反應(yīng)體系的A410nm值，并計(jì)算反應(yīng)速度，以反應(yīng)速度(V)對(duì)底物濃度([S])作圖，確定酶活力測(cè)定的底物濃度，結(jié)果見圖2。

圖2 底物濃度與反應(yīng)速度的關(guān)系Fig.2 Relationship between substrate concentration and reaction rate

從圖2可以看出，底物濃度小于6×10-5mol/L時(shí)，反應(yīng)速度隨著底物濃度的增加而增大，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?×10-5mol/L時(shí)，反應(yīng)速度達(dá)到最大值，之后，底物濃度繼續(xù)增加，反應(yīng)速度趨于不變，說明這時(shí)底物已經(jīng)過量。依據(jù)參考文獻(xiàn)[16-17]該方法的底物濃度范圍，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇3×10-4mol/L的底物濃度，以此保證在整個(gè)酶促反應(yīng)過程中有足夠的底物飽和酶。

2.4 蕎麥麩皮提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響

1mL反應(yīng)體系中，底物濃度為3×10-4mol/L，還原性谷胱甘肽濃度為8.125×10-5mol/L，酶濃度為1.06×10-7mol/L；加入不同濃度蕎麥麩皮粗提物，測(cè)其對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響，結(jié)果見圖3、4。

由圖3、4可見，無論是乙醇粗提物還是水粗提物，均有抑制α-葡萄糖苷酶的能力；作用強(qiáng)度分別為：苦蕎麩皮乙醇粗提物的水解物＞苦蕎麩皮乙醇粗提物＞甜蕎麩皮水粗提物；半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為0.0085、0.0578、17.3551g/L?？嗍w黃酮經(jīng)水解后，抑制α-葡萄糖苷酶活性顯著提高，比市售α-葡萄糖苷酶抑制劑(阿卡波糖)的抑制活性還強(qiáng)，水解物的IC50約是阿卡波糖IC50(0.0335g/L)的1/4。甜蕎麩皮水粗提物在低質(zhì)量濃度下抑制效果不明顯，在較高的質(zhì)量濃度(高于14g/L)下則表現(xiàn)出抑制活性，而純品D-手性肌醇抑制α-葡萄糖苷酶的活性非常低，其IC50為59.0612g/L。這一結(jié)果表明甜蕎麩皮水粗提物中抑制α-葡萄糖苷酶活性的主要成分不是D-手性肌醇。

圖3 苦蕎麩皮乙醇粗提物、乙醇粗提物的水解物和阿卡波糖抑制α-葡萄糖苷酶活性的比較Fig.3 Inhibition effects of the ethanol extract and its hydrolysate as well as acarbose onα-glucosidase activity

圖4 甜蕎麩皮水粗提物、D-手性肌醇抑制α-葡萄糖苷酶活性的比較Fig.4 Inhibition effects of the water extract and D-chiro-inositol on α-glucosidase activity

3 討 論

麩皮是面粉制作過程中的副產(chǎn)品，一般作為飼料利用，然而，麩皮中含有的各種活性成分遠(yuǎn)高于心粉中的含量[18]。本研究以蕎麥麩皮為原料，提取有效成分，研究其功能和作用機(jī)理?？嗍w、甜蕎分別是蕎麥屬的兩個(gè)栽培種，苦蕎麩皮中含有大量的黃酮類物質(zhì)，甜蕎麩皮中富含糖醇，黃酮類物質(zhì)溶于60%的乙醇，糖醇類物質(zhì)溶于水。本實(shí)驗(yàn)選擇苦蕎乙醇粗提物和甜蕎水粗提物為研究對(duì)象，對(duì)其具有降低血糖作用的機(jī)理進(jìn)行了研究。

黃酮是一類α-葡萄糖苷酶抑制劑，食用蕎麥能降低餐后血糖，作用途徑之一是通過蕎麥黃酮抑制α-葡萄糖苷酶的活性來實(shí)現(xiàn)的，本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果也證明了這一點(diǎn)。苦蕎麩皮乙醇粗提物經(jīng)高壓水解后，將一部分蘆丁轉(zhuǎn)化為槲皮素和異槲皮素，其抑制活性大大提高，這一結(jié)果是否與一部分蘆丁水解為槲皮素和異槲皮

素有關(guān)？為此，筆者研究了蘆丁、槲皮素和異槲皮素與α-葡萄糖苷酶的作用，結(jié)果證明槲皮素抑制α-葡萄糖苷酶活性的能力遠(yuǎn)高于蘆丁[19]。

D-手性肌醇是胰島素信號(hào)傳導(dǎo)過程中重要的中介物質(zhì)，能夠提高胰島素受體敏感性，改善胰島素抵抗，激活糖原合成酶和丙酮酸脫氫酶(PDH)，降低血糖水平[20-21]。本實(shí)驗(yàn)中甜蕎水粗提物在低質(zhì)量濃度下抑制α-葡萄糖苷酶效果不明顯，在較高的質(zhì)量濃度下表現(xiàn)出抑制活性；而D-手性肌醇純品與α-葡萄糖苷酶的作用很弱，這些均說明甜蕎麩皮水粗提物中與α-葡萄糖苷酶作用的物質(zhì)不是D-手性肌醇，而是其他水溶性的物質(zhì)。

綜上所述，苦蕎麩皮乙醇粗提物經(jīng)高壓水解后抑制α-葡萄糖苷酶活性的能力遠(yuǎn)高于目前市場(chǎng)化的高端降糖藥物拜糖平，有望開發(fā)出一種高效、無毒副作用、成本低廉的α-葡萄糖苷酶抑制劑類降糖藥物，或作為一種食品添加劑用于糖尿病人的專用食品中。蕎麥麩皮中其他物質(zhì)的成分和降糖途徑，例如水粗提物中的成分和降糖機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

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Effects of Different Solvent Extracts from Buckwheat Bran on α-Glucosidase Activity

LI Yan-qin1，ZHOU Feng-chao1，SHAN Fang2，BIAN Jun-sheng2，WANG Yao-wen1，XIA Nan1
(1.Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering, Ministry of Education, Institute of Biotechnology, Shanxi University, Taiyuan 030006, China；2.Institute of Comprehensive Utilization of Agricultural Products, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Taiyuan 030006, China)

The respective effects of buckwheat bran ethanol extract mainly composed of flavonoids and its high-pressure hydrolysate as well as the water extract from the material mainly composed of fagopyritols onα-glucosidase activity were measured using acarbose or D-chiro-inositol as a

ubstance. The major components of the ethanol extract were flavonoids, with a total content of 74.0%, in which the relative content of rutin was 86.5% and those of quercetin and isoquercetin were at trace levels according to colorimetric and HPLC determinations. However, after high-pressure hydrolysis, the content of total flavonoids in the ethanol extract increased to 76.2%, of which rutin, quercetin and isoquercetin represented 60.6%, 25.2% and 13.5%, respectively. The major components of the water extract were 43.6% D-chiro-inositol and 2.9% inositol. All the three tested samples had inhibition effect onα-glucosidase in the following decreasing order: the hydrolysate of the ethanol extract ＞the ethanol extract ＞ the water extract. Their IC50 values were 0.0085, 0.0578 g/L and 17.3551 g/L, respectively. Therefore, highpressure hydrolysis could increase the inhibition effect of buckwheat bran ethanol extract onα-glucosidase activity (the IC50 of the hydrolysate was approximately one quarter of that of acarbose; the smaller IC50, the stronger inhibition effect). In addition, the water extract did not inhibit the activity of the enzyme at low concentrations, but had inhibition effect at high concentrations.

buckwheat extract；α-glucosidase；inhibitor；diabetes

Q946.8

A

1002-6630(2010)17-0010-04

2010-04-26

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30771310)；“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2006BAD02B06)

李艷琴(1960—)，女，副教授，研究方向?yàn)橹参锓肿由飳W(xué)和植物功能成分。E-mail：yanqin@sxu.edu.cn