不同中和劑對(duì)米根霉發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的影響

姜紹通，張巧蘭，吳學(xué)鳳，羅水忠，潘麗軍

(合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230009)

不同中和劑對(duì)米根霉發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的影響

姜紹通，張巧蘭，吳學(xué)鳳，羅水忠，潘麗軍

(合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230009)

在米根霉發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸過程中，采用CaCO3作為中和劑會(huì)造成下游分離過程中膜堵塞和環(huán)保壓力，因此以NH3·H2O和NaOH替代CaCO3作中和劑，對(duì)米根霉發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的工藝條件和發(fā)酵動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究。結(jié)果表明：添加CaCO3后L-乳酸產(chǎn)量平均提高7.3倍；NaOH、NH3·H2O作為中和劑的最佳濃度及質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10mol/L、25%，以該條件進(jìn)行發(fā)酵72h得菌絲體小球直徑分別為0.2～1.2mm和1.2～2.2mm，殘?zhí)呛糠謩e為2.58g/L和1.37g/L，L-乳酸產(chǎn)量分別為74.34g/L和80.61g/L。

米根霉；L-乳酸；中和劑；發(fā)酵動(dòng)力學(xué)

L-乳酸是一種重要的天然有機(jī)酸，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、生物降解塑料等領(lǐng)域[1-3]。自然界中可產(chǎn)生L-乳酸的微生物有很多，但米根霉因其營養(yǎng)要求簡單，產(chǎn)酸能力強(qiáng)且產(chǎn)品的光學(xué)純度高而被普遍應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)[4-6]。在L-乳酸的發(fā)酵過程中，發(fā)酵生成的L-乳酸可以作為一種解偶聯(lián)劑，使質(zhì)子從培養(yǎng)基中進(jìn)入細(xì)胞的質(zhì)子泵。在這種情況下，細(xì)胞的生長和L-乳酸的生成都會(huì)隨著終產(chǎn)物L(fēng)-乳酸的積累受到抑制。因此，發(fā)酵過程中培養(yǎng)基的pH值和發(fā)酵產(chǎn)生的游離L-乳酸都會(huì)對(duì)米根霉菌體的生長和產(chǎn)物L(fēng)-乳酸的生成帶來影響[7-8]。在傳統(tǒng)的L-乳酸發(fā)酵工藝中，CaCO3是使用最為普遍的酸中和劑[8-9]。但使用CaCO3作為中和劑時(shí)，發(fā)酵罐中大量的CaCO3容易使取料口堵塞；在菌體生長過程中，容易產(chǎn)生米根霉菌體包埋現(xiàn)象；在發(fā)酵中后期，高濃度的乳酸鈣使發(fā)酵液變得黏稠，生成大量泡沫，造成跑料，易染菌[10]；或發(fā)生固化現(xiàn)象，使發(fā)酵難以繼續(xù)。另外，使用CaCO3作為中和劑時(shí)，發(fā)酵液的主要成分是粗乳酸鈣，在L-乳酸的下游分離提取過程中，產(chǎn)生的大量硫酸鈣不僅在過濾中會(huì)造成膜堵塞，造成乳酸損失，而且產(chǎn)生的大量硫酸鈣廢渣會(huì)造成嚴(yán)重的環(huán)保壓力和廢渣處理成本，不利于L-乳酸大規(guī)模生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展[11-12]。因此，尋求新型中和劑代替?zhèn)鹘y(tǒng)的CaCO3中和劑具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義，受到乳酸生產(chǎn)商和研究者的高度關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)通過以NaOH和NH3·H2O替代CaCO3作為米根霉發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的中和劑，以L-乳酸產(chǎn)量為指標(biāo)，對(duì)Ca2+添加量、菌體形態(tài)、中和劑最適濃度和發(fā)酵動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

米根霉AS3.819為合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院發(fā)酵實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基

菌種保藏斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)；以NaOH作為中和劑發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖120、 (NH4)2SO44.0、MgSO4·7H2O 0.35、ZnSO4· 7H2O 0.22、NaH2PO40.10、KH2PO40.15；以NH3· H2O作為中和劑發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 120、 (NH4)2SO41.0、MgSO4·7H2O 0.35、ZnSO4·7H2O 0.22、NaH2PO40.15、KH2PO40.15。

1.2 方法

1.2.1 搖瓶發(fā)酵

250mL三角瓶中裝液量50mL，121℃滅菌15min，接種1mL孢子懸液(5×106個(gè)/mL)，200r/min搖床上32℃振蕩培養(yǎng)72h。

1.2.27 L發(fā)酵罐發(fā)酵

7L發(fā)酵罐中裝液量5L，通氣量6L/min，攪拌轉(zhuǎn)速300r/min，pH值：分別流加NaOH、NH3·H2O溶液均保持pH值在5.5左右，32℃下培養(yǎng)72h。

1.3 檢測方法

L-乳酸產(chǎn)量測定：HPLC法[13]；還原糖含量測定：3,5-二硝基水楊酸(DNS法)；生物量測定：菌體干質(zhì)量法[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ca2+添加量的影響

Ca2+在菌絲體的生長和菌絲球的形成過程中起著非常重要的作用。分別以NaOH、NH3·H2O作為中和劑，在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入不同量的CaCO3和CaCl2進(jìn)行搖瓶實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖1～4所示。

圖1 NaOH作中和劑CaCl2質(zhì)量濃度對(duì)L-乳酸產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of CaCl2concentration onL-lactic acid production with NaOH as the neutralizer

圖2 NaOH作中和劑CaCO3質(zhì)量濃度對(duì)L-乳酸產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of CaCO3concentration onL-lactic acid production with NaOH as the neutralizer

圖3 NH3·H2O作中和劑CaCl2質(zhì)量濃度對(duì)L-乳酸產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of CaCl2concentration onL-lactic acid production with NH3·H2O as the neutralizer

圖4 NH3·H2O作中和劑CaCO3質(zhì)量濃度對(duì)L-乳酸產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of CaCO3concentration onL-lactic acid production with NH3·H2O as the neutralizer

由圖1、3可知，添加Ca2+后L-乳酸產(chǎn)量顯著提高。隨著CaCl2質(zhì)量濃度增加，L-乳酸產(chǎn)量先上升后下降，可能是高質(zhì)量濃度的Cl-對(duì)菌體有毒害作用，因此不采用CaCl2；由圖2、4可知，隨著CaCO3質(zhì)量濃度增加，L-乳酸產(chǎn)量不斷提高，參照最佳CaCl2最佳質(zhì)量濃度，選用2g/L CaCO3，因CaCO3易在發(fā)酵罐中沉淀，無法完全利用，可適當(dāng)增加CaCO3用量。如圖1、2所示，以NaOH作為中和劑時(shí)，添加CaCO3和CaCl2后L-乳酸最大產(chǎn)量分別是未添加Ca2+的8.8倍和6.6倍。如圖3、4所示，以NH3·H2O作為中和劑時(shí)，添加CaCO3和CaCl2后L-乳酸最大產(chǎn)量分別是未添加Ca2+的8.5倍和5.3倍。

2.2 中和劑質(zhì)量濃度對(duì)L-乳酸產(chǎn)量及L-乳酸/葡萄糖總得率的影響

2.2.1 NaOH濃度對(duì)L-乳酸產(chǎn)量及L-乳酸/葡萄糖總得率的影響

在7L發(fā)酵罐中對(duì)NaOH濃度進(jìn)行優(yōu)化，且由于低產(chǎn)量NaOH溶液和高濃度NaOH溶液加入的量不同使最終L-乳酸濃度產(chǎn)生差別，因此將發(fā)酵完成時(shí)的發(fā)酵罐總體積內(nèi)L-乳酸的質(zhì)量與初始葡萄糖質(zhì)量進(jìn)行對(duì)比得出L-乳酸/葡萄糖總得率，結(jié)果如圖5所示。

圖5 NaOH濃度對(duì)L-乳酸產(chǎn)量及L-乳酸/葡萄糖得率的影響Fig.5 Effect of NaOH concentration onL-lactic acid production and the ratio ofL-lactic acid production to initial glucose amount

由圖5可知，在2～10mol/L范圍內(nèi)，L-乳酸產(chǎn)量隨著NaOH濃度增大而增多，L-乳酸/葡萄糖得率也不斷增加；而超過10mol/L時(shí)L-乳酸產(chǎn)量下降，可能是隨著NaOH濃度的增加，堿性增強(qiáng)，流加時(shí)發(fā)酵罐內(nèi)局部堿性很大，對(duì)菌體的毒害作用增強(qiáng)，導(dǎo)致部分菌體死亡，有效菌體量減少，從而使L-乳酸產(chǎn)量相應(yīng)減少，L-乳酸/葡萄糖得率也下降，因此選擇10mol/L為最佳濃度，在此濃度下L-乳酸產(chǎn)量為74.34g/L。

2.2.2 NH3·H2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)L-乳酸產(chǎn)量及L-乳酸/葡萄糖總得率的影響

圖6 NH3·H2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)L-乳酸產(chǎn)量及L-乳酸/葡萄糖得率的影響Fig.6 Effect of NH3·H2O concentration onL-lactic acid production and the ratio ofL-lactic acid production to initial glucose amount

在7L發(fā)酵罐中對(duì)NH3·H2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行優(yōu)化，且由于低質(zhì)量分?jǐn)?shù)NH3·H2O和高質(zhì)量分?jǐn)?shù)NH3·H2O加入的量不同使最終L-乳酸產(chǎn)量產(chǎn)生差別，因此將發(fā)酵完成時(shí)的發(fā)酵罐總體積內(nèi)L-乳酸的質(zhì)量與初始葡萄糖質(zhì)量進(jìn)行對(duì)比得出L-乳酸/葡萄糖總得率，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，隨著NH3·H2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，L-乳酸產(chǎn)量不斷上升，L-乳酸/葡萄糖得率也不斷增加，分析原因可能是因?yàn)镹H3·H2O不僅能中和發(fā)酵產(chǎn)生的L-乳酸，還可以作為氮源促進(jìn)米根霉菌體的生長，L-乳酸的產(chǎn)生導(dǎo)致發(fā)酵罐內(nèi)p H值下降，NH3·H2O流加進(jìn)入發(fā)酵罐，發(fā)酵液中NH4+濃度不斷增加，NH4+一部分作為氮源供米根霉菌體生長所用，一部分中和L-乳酸產(chǎn)生L-乳酸銨，因此NH3·H2O可能是米根霉發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸比較理想的中和劑。由于市面所售NH3·H2O最高質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%，因此選擇25% NH3·H2O，此質(zhì)量濃度下L-乳酸產(chǎn)量為80.61g/L。

2.3 不同中和劑的菌體形態(tài)

分別使用10mol/L NaOH和25% NH3·H2O作為米根霉發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的中和劑，在7L發(fā)酵罐中發(fā)酵7 2 h，發(fā)酵液澄清透明，米根霉菌體形成菌絲體小球，無任何碳酸鈣包埋現(xiàn)象，其中以N H3·H2O作為中和劑時(shí)，米根霉的菌體形態(tài)較為合適，NaOH作為中和劑時(shí)菌球偏小，如表1所示。發(fā)酵初期的前24h，米根霉菌體呈絮狀，24h后開始形成菌絲體小球，到發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)菌體絲小球直徑分別為0.2～1.2mm和1.2～2.2mm，發(fā)酵終點(diǎn)米根霉菌絲體小球形態(tài)如圖7、8所示。

表1 中和劑對(duì)米根霉菌絲體生長的影響Table 1 Effect of neutralizers on mycelial growth ofRhizopus oryzae

圖7 NaOH作為中和劑時(shí)的菌球形態(tài)Fig.7 Mycelial pellets ofRhizopus oryzaewith NaOH as the neutralizer

圖8 NH3·H2O作為中和劑時(shí)的菌球形態(tài)Fig.8 Mycelial pellets ofRhizopus oryzaewith NH3·H2O as the neutralizer

2.4 不同中和劑的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)

2.4.1 以10mol/LNaOH作為中和劑時(shí)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)曲線

測定發(fā)酵液中的米根霉生物量、葡萄糖質(zhì)量濃度和L-乳酸質(zhì)量濃度，得出以10mol/L NaOH作為米根霉發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸中和劑的動(dòng)力學(xué)，結(jié)果如圖9所示。

圖9 以NaOH作為中和劑的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)曲線Fig.9 Fermentation kinetic curve with NaOH as the neutralizer

由圖9可知，米根霉菌體的生長曲線和L-乳酸的生成曲線都呈S形。發(fā)酵初期0～24h，以菌體的生長為主，產(chǎn)酸很少，葡萄糖消耗速度緩慢。24h后進(jìn)入產(chǎn)酸旺盛期，L-乳酸的合成與米根霉菌體的生長同步，L-乳酸產(chǎn)量增加的趨勢與米根霉菌絲體增長的趨勢基本一致，葡萄糖的消耗速度加快。54h后菌絲體含量變化不大，耗糖速度和產(chǎn)酸均變緩慢，發(fā)酵進(jìn)入穩(wěn)定期，72h發(fā)酵結(jié)束，L-乳酸的產(chǎn)量達(dá)到峰值。

2.4.2 以25% NH3·H2O作為中和劑時(shí)的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)曲線

圖10 以NH3·H2O作為中和劑的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)曲線Fig.10 Fermentation kinetic curve with NH3·H2O as the neutralizer

測定發(fā)酵液中的米根霉生物量、葡萄糖質(zhì)量濃度和L-乳酸質(zhì)量濃度，研究以25%NH3·H2O作為米根霉發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸中和劑的菌體生長、糖代謝和產(chǎn)酸動(dòng)力學(xué)，結(jié)果如圖10所示。

由圖10可知，米根霉菌體的生長曲線和L-乳酸的生成曲線都呈S形，葡萄糖消耗曲線呈反S形。發(fā)酵初期12h，菌體生長緩慢，菌絲體含量與L-乳酸產(chǎn)量很少。24～60h進(jìn)入米根霉生長與L-乳酸生產(chǎn)旺盛期，菌體迅速生長，葡萄糖的消耗速度加快，L-乳酸產(chǎn)量也隨之迅速增加。60h后進(jìn)入穩(wěn)定期，L-乳酸增加緩慢，72h發(fā)酵結(jié)束，L-乳酸產(chǎn)量達(dá)最高值。

3 結(jié) 論

本研究利用NaOH和NH3·H2O作為米根霉發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的中和劑，通過Ca2+添加量、菌體形態(tài)、中和劑最佳濃度、動(dòng)力學(xué)測定研究得出：Ca2+在米根霉菌體生長過程中起非常重要的作用，其中CaCO3優(yōu)于CaCl2，添加了CaCO3后L-乳酸產(chǎn)量平均提高7.3倍；NH3·H2O、NaOH作為米根霉發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸中和劑的最佳濃度及質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為25%和10mol/L，在最佳質(zhì)量濃度下進(jìn)行7L罐發(fā)酵72h，殘?zhí)橇糠謩e達(dá)到2.58g/L和1.37g/L，L-乳酸產(chǎn)量分別達(dá)到74.34g/L和80.61g/L。

[1]RATHIN D. Hydroxycarboxylic acids[J]. Encyclopedia of Chemical Technology, 1995, 13: 1042-1062.

[2]RATHIN D. The technology and economy potential of poly (lactic acid) and its ramification[J]. FEMS Microbiology Reviews, 1995, 16: 221-231.

[3]白冬梅, 趙學(xué)明, 李鑫鋼, 等. 米根霉發(fā)酵生產(chǎn)L-(+)-乳酸研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代化工, 2002, 22(6): 9-12.

[4]王博彥, 金其榮. 發(fā)酵有機(jī)酸生產(chǎn)與應(yīng)用手冊(cè)[M]. 北京: 中國輕工業(yè)出版社, 2007: 337-389.

[5]王蓉, 王遠(yuǎn)亮, 陳國平, 等. 米根霉發(fā)酵生產(chǎn)L(+)-乳酸研究進(jìn)展[J].重慶大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2004(12): 95-97.

[6]趙宏宇, 趙靖, 鄭春麗, 等. 米根霉乳酸發(fā)酵的研究進(jìn)展[J]. 天津化工, 2007(1): 7-9.

[7]閆征, 王昌祿, 顧曉波. pH值對(duì)乳酸菌生長和乳酸產(chǎn)量的影響[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2002(6): 35-38.

[8]徐國謙, 儲(chǔ)炬, 王永紅, 等. 不同的中和劑對(duì)L(+)-乳酸發(fā)酵的影響[J]. 工業(yè)微生物學(xué), 2007(4): 1-5.

[9]閆智慧, 白冬梅, 高靜, 等. 氨水中和Lactobacillus delbrueckii subsp. Lactis BME5-18M發(fā)酵生成L-乳酸銨的研究[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2004 (4): 31-33.

[10]匡群, 孫梅, 施大林, 等. 耐氨米根霉發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的研究[J]．生物技術(shù), 2005(4): 65-67.

[11]MIURA S, DWIARTI L, ARIMUR T, et al. Enhanced production of L-lactic acid by mmonia-tolerant mutant strain Rhizopus sp. MK-96-1196 [J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2004(1): 19-23.

[12]LI Xingang, XU Shimin. Ammonium lactate production by Lactobacillus lactis BME5-18M in pH-controlled fed-batch fermentations[J]. Biochemical Engineering Journal, 2004, 19(1): 47-51.

[13]鄭志, 姜紹通, 潘麗軍, 等. 反相高效液相色譜法測定發(fā)酵液中乳酸的含量[J]. 食品科學(xué), 2003, 24(12): 89-91.

[14]賈士儒. 生物工藝與工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M]. 中國北京: 輕工業(yè)出版社, 2002: 1-4.

Effect of Different Neutralizers on L-Lactic Acid Production by Rhizopus oryzae

JIANG Shao-tong，ZHANG Qiao-lan*，WU Xue-feng，LUO Shui-zhong，PAN Li-jun
(Key Laboratory for Agricultural Products Processing of Anhui Province, School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Calcium carbonate added as the neutralizer during Rhizopus oryzae fermentation for L-lactic acid production would cause membrane fouling and environmental pressure during the downstream separation. As a consequence, ammonia and sodium hydroxide were separately used as a substitute for calcium carbonate in this study, and the fermentation conditions for L-lactic acid production and the fermentation kinetics were dealt with. Added calcium carbonate during during Rhizopus oryzae fermentation resulted in an average 7.3-fold increase in L-lactic acid production. The optimal concentrations of added ammonia and sodium hydroxide were 10 mol/L and 25%, respectively. Mycelial pellets in diameter ranges between 0.2 mm and 1.2 mm and between 1.2 mm and 2.2 mm were formed after 72 h fermentation under these concentration conditions, and the residual sugar amounts were 2.58 g/L and 1.37 g/L and the L-lactic acid concentrations in the fermentation broths were 74.34 g/L and 80.61 g/L, respectively.

Rhizopus oryzae；L-lactic acid；neutralizer；fermentation kinetics

TQ921.3

A

1002-6630(2010)23-0114-04

2009-12-22

國家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA10Z361)；安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(090411015)

姜紹通(1954—)，男，教授，主要從事農(nóng)產(chǎn)品生物化工研究。E-mail：jiangshaotong@yahoo.com.cn