門靜脈高壓癥大動物模型的研制進展

鄧禮明，張啟瑜

(溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院 肝膽外科，浙江 溫州 32500)

用于制造門脈高壓癥動物模型最常用的動物為鼠與兔，但如欲對門靜脈高壓癥的手術(shù)方式進行研究，則小動物模型難以達到預期的效果且操作不方便，因此選擇一種理想的大動物門靜脈高壓癥模型，對于評價外科治療效果非常重要。多年來，國內(nèi)外學者探討了多種制備門靜脈高壓癥大動物模型的方法，每種方法都有其優(yōu)點，但也有其局限性，現(xiàn)綜述如下。

1 肝前型門脈高壓癥模型的制作

1.1 縮窄門靜脈主干制作模型 將門靜脈主干部分縮窄可減少門靜脈口徑，使血液回流受阻從而導致門脈壓力升高。1980年Van Thiel[1]首次報道此方法：把一個20號鈍頭直針縱向置于門靜脈主干旁，用絲線將門靜脈和直針結(jié)扎后抽出直針，可造成門靜脈一定程度的狹窄，從而建立門脈高壓癥動物模型。理論上講，完全阻斷門靜脈可使門靜脈壓力升高最多，但一次完全結(jié)扎門靜脈可導致嚴重的胃腸淤血及肝臟缺血，除恒河猴外幾乎毫無例外地會導致實驗動物死亡。國內(nèi)學者李宗芳[2]采用門靜脈主干縮窄1/2加絲線慢性栓塞的方法，成功通過一次手術(shù)而逐漸完全阻斷門靜脈，成功制成犬的肝前型門靜脈高壓癥模型。術(shù)后動物存活率為95.5%，術(shù)后2周門靜脈造影見主干已閉塞，術(shù)后3～4周門靜脈壓力升為(2.83±0.66)kPa，胃鏡檢查食管胃底靜脈曲張形成率為80.9%。此后趙莉等[3]對實驗犬部分結(jié)扎門脈使其截面積縮小95%后，分別在術(shù)后不同時間再次開腹觀察，發(fā)現(xiàn)2～8周門脈壓較高，但隨著側(cè)支循環(huán)的建立，壓力逐漸下降，12～16周門脈壓才趨于穩(wěn)定。門靜脈主干部分結(jié)扎形成門脈高壓癥動物模型具有制作簡單、可復制性強、門脈壓力升高迅速，側(cè)支循環(huán)形成明顯等特點。但該類模型肝臟組織學幾乎正常，門脈壓力隨側(cè)支循環(huán)的開放而逐漸下降，主要適于門靜脈系統(tǒng)高動力循環(huán)狀態(tài)的研究，以及門靜脈高壓癥前向性學說的探討。

1.2 門-腔靜脈吻合制作模型 Saku等[4]提出用血流量較大的下腔靜脈與門靜脈吻合制作犬門靜脈高壓癥模型，由于壓力形成不穩(wěn)定，效果不理想。Dennis等[5]在此基礎上又同時縮窄門靜脈主干，使模型制作效果有很大提高。其方法是，開腹行下腔靜脈和門靜脈主干的側(cè)側(cè)吻合，吻合口長度約2.5～3.0cm，于吻合口上方的門靜脈內(nèi)置入1個內(nèi)含瓊脂環(huán)的鋼圈起固定作用。瓊脂吸水后不斷膨脹而逐漸阻塞門靜脈，在吻合口上方雙重結(jié)扎腔靜脈，使其下方的血液完全注入門靜脈系統(tǒng)。用此法3～6周后全部成模，無死亡，門靜脈壓力明顯增高，食管胃底靜脈叢呈不同程度曲張，肝臟組織學改變不明顯。

秦云峰等[6]對上述方法做了改進，在下腔靜脈-門靜脈側(cè)側(cè)吻合、下腔靜脈結(jié)扎及門靜脈部分縮窄的基礎上，采用介入放射學經(jīng)導管栓塞技術(shù)處理門靜脈，經(jīng)導管用自制不銹鋼絲卷阻塞門脈肝端。該方法造模的犬全部成活，吻合口通暢，術(shù)后門脈壓力高，胃鏡和X線門脈造影以及病理切片證實食管下段黏膜下曲張靜脈形成。

黃莚庭等[7]也在犬上施行大口徑門腔側(cè)側(cè)吻合術(shù)，然后在吻合口的近心側(cè)結(jié)扎下腔靜脈，做成腔門轉(zhuǎn)流術(shù)后門靜脈高血流狀態(tài)的動物模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)門靜脈盡管可以穩(wěn)定地保持高血流狀態(tài)，門靜脈壓力也持續(xù)不同程度地升高，但無明顯側(cè)支形成，肝臟也無組織學變化，肝功能良好，可見單純的門靜脈高血流狀態(tài)并不能很好地形成門靜脈高壓癥。而徐輝等[8]采用改良Stiegmann方法，對實驗犬門靜脈結(jié)扎，使門靜脈管徑縮小40%～60%，同時在腎上水平橫斷下腔靜脈，近段關閉，遠端與門靜脈行端側(cè)吻合，建立穩(wěn)定的門靜脈高壓食管靜脈曲張動物模型。

門-腔靜脈吻合制作的門脈高壓癥動物模型，門靜脈壓力高，且相對穩(wěn)定，形成明顯的側(cè)支靜脈曲張，是具有食管胃底靜脈曲張的門靜脈高壓癥大動物模型，成功率高，重復性好，死亡率低，為食管胃底靜脈曲張及內(nèi)窺鏡注射硬化劑治療出血的研究提供了便利條件。

2 肝內(nèi)型門靜脈高壓癥動物模型

2.1 四氯化碳誘導肝硬化門靜脈高壓模型 1936年Cameron和Karunaratne[9]首次報道應用四氯化碳制作肝硬化動物模型。大動物最常見的給藥途徑是口服和腹腔注射。1993年國內(nèi)學者呂明德等[10]采用復合致病因子法成功制備了狗肝硬化模型，通過腹腔注射CC14，外加高脂低蛋白飲食與飲用乙醇水增加了肝細胞對CC14敏感性，促進肝臟病變。于實驗第8周末肝硬化形成率達91%。 此后國內(nèi)學者劉小玲[11]通過經(jīng)胃管胃腸灌注CC14法建立穩(wěn)定的犬肝硬化門脈高壓模型，死亡率為27%。

曹罡等[12]采用門脈置管四氯化碳注射法制備狗肝硬化模型，即選取犬脾靜脈屬支插入硅膠管至近脾靜脈主干處固定后，定期經(jīng)導管緩慢滴注四氯化碳脂肪乳的葡萄糖稀釋液。此給藥方式不僅可根據(jù)動物體重及一般情況變化靈活調(diào)節(jié)藥量、濃度及給藥速度，而且對腹腔干擾輕微，非常有利于進一步進行外科學研究。而周忠信等[13]采用CC14與加苯巴比妥鈉配合高脂低蛋白低膽堿飲食制備小型豬肝硬化門脈高壓癥模型，實驗成員以廣西巴馬小型豬為實驗對象，每日飼以經(jīng)調(diào)配的高脂低蛋白低膽堿飲食，由65%米飯加35%豬油和膽固醇混合組成，無水乙醇稀釋成10%作為唯一飲料。12頭小型豬于實驗16周末均成功誘導出肝硬化，按Madden分級法[14]，17頭達到I級，5頭達到IV級，成功率為100%，死亡率為零。

CCl4所誘導的肝硬化模型有一定程度的門體分流，與人類營養(yǎng)障礙型肝硬化較為相似，經(jīng)常被用來研究肝硬變后門脈高壓癥的血流動力學變化，但是該模型的纖維化和肝結(jié)節(jié)形成程度相對較輕，并且全身毒性作用大，可導致多器官功能衰竭，因此存在死亡率高的缺點，影響了其應用范圍。

2.2 二甲基亞硝胺（DMNA）誘導肝硬化門脈高壓癥動物模型 DMNA主要在肝內(nèi)微粒體藥物氧化酶系統(tǒng)進行氧化代謝后，產(chǎn)生活性甲基、酯酰烷基亞硝、甲烷亞硝胺胺等中間代謝產(chǎn)物，具有肝細胞毒性，導致肝細胞壞死，造成實驗動物彌漫性、特異性損害。1937年，英國學者Freund首先報道了2例有明顯DMNA接觸史的肝硬化病例，因而國內(nèi)學者金樹根[15]以此采用DMNA蒸汽吸入對犬進行染毒，成功復制類似上述病例的肝臟再生結(jié)節(jié)性肝硬化，首次用DMNA成功地制備出大動物肝硬化模型，其后通過口服[16]、靜脈內(nèi)給藥[17]成功復制出門脈高壓動物模型。一般形成門脈高壓狀態(tài)需5周左右，但出現(xiàn)明顯的肝硬化及腹水需要3、4個月[18-19]。該種方法不足之處是：DMNA本身是一種致癌物質(zhì)，毒性大、易揮發(fā)，影響周圍環(huán)境和人群，近年來，選用此種方法制備動物肝硬化模型很少見。

2.3 膽總管結(jié)扎法致肝硬化門脈高壓癥動物模型 通過結(jié)扎縮窄膽總管，使膽汁排出受阻，肝內(nèi)膽汁淤積，制作肝硬化的模型。 Gliedman等[20]發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)血管系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的扭曲和變形是該模型形成門脈高壓癥的重要原因。Shasha等[21]以犬作為實驗對象，結(jié)扎膽管，4周后成功地制備了狗膽汁性肝硬化、門脈高壓模型，用于研究膽汁性肝硬化血液動力學變化。此后Bosch等[22]對犬進行膽總管結(jié)扎，并對全身及門靜脈區(qū)的血流動力學進行研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過8周后模型的門靜脈壓力達到(1.77±0.08)kPa，制成了門脈高壓模型，證實膽汁性肝硬化血液動力學變化與人類相似的觀點，并用于評價肝硬化、門脈高壓藥物治療效果。此外，這種大動物門脈高壓模型也適合觀察膽汁性肝硬化的外科手術(shù)治療效果，國內(nèi)史留斌等[23]、裘法祖[24]先后采用此方法復制出大動物肝硬化模型，并用于藥物及手術(shù)治療效果的評價。此建模方法較成熟，在猴等其他大動物身上也取得成功[25]。

膽總管結(jié)扎法制作的門脈高壓癥模型，門靜脈壓力升高顯著，并可出現(xiàn)廣泛的門體分流。該模型與人類肝硬化患者在門脈及全身血流動力學方面有較好的相似性，適合對門脈高壓癥病理生理進行研究，是驗證藥物對門脈高壓癥作用的有效模型，還適合用于膽汁性肝硬化研究。但是存在以下缺陷：死亡率高達50%，腹腔黏連，不利于下一步外科手術(shù)操作，膽管解剖變異導致建模失敗。

2.4 門脈末梢栓塞制備門靜脈高壓癥模型 1957年Taylor首先介紹門靜脈注入二氧化硅混懸液建立犬肝硬化門脈高壓癥模型的方法。此后Buergener[26]用聚乙烯醇(polyvinylalcohol，PVA)以狗為對象制作門靜脈高壓癥模型。PVA是一種永久性血管阻塞因子，與血吸蟲卵相似，阻塞于門靜脈分支末梢，引起匯管區(qū)炎癥，逐漸產(chǎn)生肝硬化。其方法是經(jīng)皮膚穿刺，將套管置入門靜脈主干，注入PVA，每次0.1～0.9 g，每隔1～2周1次，每次由0.1 g開始，逐漸加量至門靜脈壓達到或超過20 cmH2O，并穩(wěn)定于此。3個月后成模，隨著肝內(nèi)門靜脈較大分支被阻塞，狗存活率下降。成模后門靜脈壓力顯著增高，3～4周后，出現(xiàn)門體側(cè)支循環(huán)，8個月后肝臟呈不同程度增生。

此后，大西久仁彥等[27]用大腸桿菌成功地制作出狗門靜脈高壓癥模型。其方法是將非致病性大腸桿菌用1%福爾馬林殺滅，再將其煮沸，使其只具有O抗原，并制成O抗體血清，將該血清和被殺死的大腸桿菌按比例混合后置于50 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，再把此種混合液以4 mL/kg，由腸系膜上靜脈插管注入到門靜脈， 2周內(nèi)注入7～10次，1個月后再注入1次，2.5個月后即可成模。成模后門靜脈壓力顯著增高，血流量增大，阻力增高；脾臟重量增加，血流量增大，阻力下降；空腸、回腸、結(jié)腸及網(wǎng)膜血流量增大，同時阻力下降；病理檢查示門靜脈末梢纖維化、萎縮及狹窄，門靜脈區(qū)血管紊亂，該模型適用于特發(fā)性門靜脈高壓癥的研究。

國內(nèi)學者王瑞祥等[28]在犬上用埋入式藥泵置入門靜脈主干后，按100 mg/kg的劑量經(jīng)藥泵分批次注入100～400μm PVA顆粒，3個月后形成不同程度肝纖維化門靜脈高壓癥，并有不同程度的脾大及腹水?？紤]到PVA主要依賴進口，陳軍等[29]采用300～500μm的葡聚糖微球以10 mg/kg的劑量，每5天注射葡聚糖微球1次，經(jīng)門靜脈留置導管注入豬門靜脈，22d制成豬竇前型門靜脈高壓癥模型，而葡聚糖微球是一種長效栓塞劑，球與血液等比重，栓子不易結(jié)塊，使用方便，療效持久。

門靜脈末梢栓塞法制備門靜脈高壓癥模型，方法簡單，動物存活率及成功率較高，并可經(jīng)藥泵反復進行門靜脈造影，了解側(cè)支循環(huán)開放情況。所制備的動物模型，其肝內(nèi)門靜脈血流梗阻更符合臨床，門靜脈壓力升高迅速，適合竇前型肝硬化與肝硬化血流動力學改變及門體分流的研究。

3 肝后型門靜脈高壓癥動物模型

肝后型門脈高壓癥臨床上最常見的疾病為Budd-Chiari syndrome，即肝流出道阻塞引起的病理生理學改變。通過置入縮窄環(huán)于肝上段下腔靜脈或肝靜脈與下腔靜脈匯合處，逐漸形成肝靜脈流出道阻塞。結(jié)扎肝靜脈或肝靜脈匯入腔靜脈處下游的下腔靜脈，可造成肝充血及腹水為特征的肝后型門靜脈高壓模型，單純使用本方法，并不能或僅能產(chǎn)生暫時性門靜脈高壓。

國內(nèi)學者白殿卿等[30]在犬上用進腹途徑采用左肝靜脈縮窄的方法建立肝后性門脈高壓動物模型，此模型在術(shù)后平均7d即出現(xiàn)腹水，適用于門脈高壓癥腹水方面的研究。此后，王春喜等[31]通過介入技術(shù)找出犬肝右靜脈和肝左靜脈，保留一支主干肝靜脈，通過注入無水乙醇破壞肝靜脈的內(nèi)膜，送入鋼絲圈和明膠海綿進一步阻塞肝靜脈和局部血栓形成，逐漸形成肝靜脈閉塞或嚴重狹窄，造成肝臟血液回流障礙，瘀血性肝臟腫大，逐漸形成肝硬化門靜脈高壓，并出現(xiàn)胃底食管靜脈迂曲擴張現(xiàn)象，病理切片下形態(tài)學結(jié)構(gòu)與人類肝靜脈阻塞引起的肝硬變即布加氏綜合征形成的肝硬變一致。但介入方法的實施需要專門的技術(shù)與特殊的設備，限制了模型的廣泛使用，而且這種模型血流動力學干擾大，不適于這方面研究。

綜上所述，制備門脈高壓癥大動物模型的方法雖多，但是與人們預期目標存在較大差距。理想的大動物門脈高壓癥模型應具備以下條件：與人類肝硬化門脈高壓的特征相同，造模成功率高，死亡率低，周期短，方法簡單易行；造模因素對人體無害或者較少危害，環(huán)境污染小；腹腔干擾少，利于外科手術(shù)操作等。然而目前尚無一種理想的大動物門脈高壓癥模型能夠滿足上述要求，因而，尋找理想的門脈高壓癥大動物模型需要進一步探索和研究。

[1]Van Thiel DH, Gavaler JS, Slone FL, et al.Is feminization in alcoholic men due in part to portal hypertension: a rat model[J].Gastroenterology,1980,78(1):81-91.

[2]李宗芳,劉效恭,王英,等. 縮窄門靜脈主干12加絲線慢性栓塞術(shù)制備犬門靜脈高壓癥模型 [J].中華實驗外科雜志,1997,14(5):314-316.

[3]趙莉,李振東,于增文,等.肝前型門靜脈高壓癥動物(犬)模型制作體會[J].中華小兒外科雜志,2001,22(1):42-44.

[4]Saku M,Borgesson B,Olin T,et al.An attempt to induce portal hypertension and esophageal varices in the rat [J].Eur Surg Res,1976,8(2):166-171.

[5]Dennis ML,Gustavo AM,Jorge IT,et al.A reproducible canine model of esophageal varices [J].Gastroenterology,1983,894(2):573-579.

[6]秦云峰.狗門脈高壓癥食管曲張靜脈模型的制備 [J].中華實驗外科雜志,1987,4(1):19.

[7]黃莚庭,王維民,韓鐵然,等.門靜脈高血流狀態(tài)的動物實驗研究 [J].中華外科雜志,1993,31(4):195-199.

[8]徐輝,陳虹彬,蔣明德,等.合金支架治療食管靜脈曲張出血的實驗研究[J].西南國防醫(yī)藥,2003,13(4):358-360.

[9]Cameron CR, Karunaratne WAE. Car-bon tetrachloride cirrhosis in relation toliver regeneration [J].J Path Bact,1936,42(1):1-21.

[10]呂明德,黃潔夫.腹腔注射四氯化碳配合營養(yǎng)控制制備犬肝硬模型[J].中華實驗外科雜志,1993,10(2):56-57.

[11]劉小玲.經(jīng)胃管胃腸灌注法建立穩(wěn)定的犬肝硬化門脈高壓模型的觀察[J].局解手術(shù)學雜志,1994,3(4-12):29-30.

[12]曹罡,黎一鳴.門脈置管四氯化碳注射法制備狗肝硬化模型[J].中華肝膽外科志,2001,7(4):244-245.

[13]周忠信,王捷,羅葆明.小型豬肝硬化模型建立過程中肝臟功能及組織病理學的改變 [J].上海實驗動物科學,2002,22(2):102-104.

[14]Zerm MA,Saber MA,Shafritz DA.Molecular mechanisms for changes in heptic protein synthesis induce by schistosomiasis infection in mice [J].Biochemistry,1983,22(26):6072-6077.

[15]金樹根.二甲基亞硝胺致實驗性肝損傷的研究概況 [J].中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志,1993,3(1):49-51.

[16]Madden JW,Gertman PM,Peacock EE.Dimethylnitrosamine induced hepatic cirrhosis:a new canine model of an ancient human disease [J].Surgery,1970,68(1):260-267.

[17]Mwanza,Miyamoto,Okumura M,et a1.Ultrasonography,biochemical and hematological profiles in liver disease caused byinfavenous administration of dimethylnitrosamine in dogs[J].Jpn J Vet Res,1997,45(3):153-l61.

[18]Tsukamoto H, Matsuoka M, French SW. Experimental models of hepatic fibrosis:a review [J].Semin Liver Dis,1990,(10):56-65.

[19]Jenkins SA,Grandison A,Baxter JN,et a1.A dimethylnitrosamine-induced model of cirrhosis and portal hypertension in the rat [J].J Hepatol,1985,1(5):489-499.

[20]Glidman ML,Girardet RE,Schwartz A,et al.Heptic vascular anatomy and manometry in experimental biliary obstruction and ascites [J].Surg Gynec Obstet,1964,119:749-757.

[21]Shasha SM,Better OS,Chaimovitz C,et a1.Haemodynamic studies in dogs with chronic bile duct ligation [J].Clin Sci Mol Med,1976,50(6):533-537.

[22]Bosch J,Enriquez R,Groszmann RI,et a1.Chronic bile duct ligation in the dog:hemodynamic characterization of a portal hypertensive model [J].Hepatology,1983,3(6):1002-1007.

[23]Shi LB,Peng CH,Peng SY,et a1.Preliminary experimental study on treatment of portal hypertension with auxiliary partial orthotopic live transplantation [J].Zhongguo Wei Zhong Bing Jig Jiu Yi Xue,2004,16(12):730-733.

[24]鄧小榮,楊鎮(zhèn),裘法祖.門脈高壓癥豬脾組織中內(nèi)皮素受體及誘導型一氧化氮合酶mRNA表達的意義 [J].華中科技大學學報:醫(yī)學版,2002,31(5):540-546.

[25]Hellerbrand C,Stefanovie B,Giordano F,et al.The role of TGF betal in inititating heptic stellate cell activation in vivo [J].Hepatol,1999,30(1):77-87.

[26]李德旭,楊鎮(zhèn),邱新光,等.豬膽汁性纖維化的形成機制研究 [J].中華實驗外科雜志,2003,20(1):16-l7.

[27]Buergener FA,Gutierrez OH,Logsdon GA.Angiographic, hemodynamic and hitologic evaluation of portal hypertension and periportal fibrosis induced in the dog by intraportal polyvinyl alcohol injections [J]. Radiology,1982,143(3):379-385.

[28]王瑞祥,宣正榮,斐振安,等.門靜脈內(nèi)注射PVA制作犬肝內(nèi)型門脈高壓癥模型[J].肝膽外科雜志,1996,4(4):241-243.

[29]陳軍,吳性江,黎介壽.門靜脈內(nèi)注射葡聚糖微球制成豬門靜脈高壓癥模型[J].中華實驗外科雜志,2005,22(6):755-757.

[30]白殿卿,詹峰,鄭穎.犬肝靜脈阻力制做腹水實驗模型的改進[J].中華實驗動物學雜志,2002,12(1):28-30.

[31]王春喜,梁發(fā)啟,韓麗娜,等.肝靜脈阻塞型布加氏綜合征動物模型的制作[J].中華實驗外科雜志,2005,22(4):494-495.