構(gòu)樹(shù)皮中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的成分

鮑 玲,崔文峰,郁建平,喻凱,王明奎＊

1中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所中國(guó)科學(xué)院山地生態(tài)恢復(fù)與生物資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,生態(tài)恢復(fù)與生物多樣性保育四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 610041;2貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,貴陽(yáng) 550025;3西南交通大學(xué)生物工程學(xué)院,成都 610031

構(gòu)樹(shù)皮中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的成分

鮑 玲1,崔文峰2,郁建平2,喻凱3,王明奎1＊

1中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所中國(guó)科學(xué)院山地生態(tài)恢復(fù)與生物資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,生態(tài)恢復(fù)與生物多樣性保育四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 610041;2貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,貴陽(yáng) 550025;3西南交通大學(xué)生物工程學(xué)院,成都 610031

本文報(bào)道構(gòu)樹(shù)皮中α-葡萄糖苷酶抑制劑的分離鑒定。構(gòu)樹(shù)皮的乙醇浸膏通過(guò)溶劑萃取以及各種柱層析方法分離純化得到 6個(gè)化合物,通過(guò)波譜學(xué)方法鑒定為:broussonetine A(1),broussonetinine A(2),broussonetinine B(3),黑立脂素苷 (liriodendrin)(4),butyrospermyl acetate(5)以及胡蘿卜苷 (6)。所有化合物均首次從構(gòu)樹(shù)中分離得到,其中 1～3具有較強(qiáng)抑制α-葡萄糖苷酶的活性,IC50有分別為 0.530、0.445和 0.460 mg/ mL。

構(gòu)樹(shù);broussonetine A;broussonetinine A;broussonetinine B;α-葡萄糖苷酶抑制劑

構(gòu)樹(shù) (B roussonetia papyrifera(L.)Vent)為?？茦?gòu)屬直立落葉喬木,廣泛分布于全國(guó)各地。構(gòu)屬植物全世界共有四種,中國(guó)產(chǎn)三種,其中兩種可作藥用[1]。構(gòu)樹(shù)的果實(shí)、樹(shù)葉、枝條、莖皮部乳汁和根皮均可入藥,具有補(bǔ)腎清肝,明目利尿、健胃、消炎、涼血止血之功效,用于腰膝酸軟,虛勞骨蒸,頭暈?zāi)炕?目生翳膜,水腫脹滿(mǎn)。現(xiàn)代藥理研究表明其具有很好的抗真菌作用。國(guó)外學(xué)者從小構(gòu)樹(shù) (B.kazinoki Sieb)中還分離得到很多對(duì)α-葡萄糖苷酶有較好抑制作用的多羥基生物堿[2-10],對(duì)構(gòu)樹(shù)根皮也進(jìn)行過(guò)研究,從中分離出大量的黃酮和二苯丙烷類(lèi)化合物,但還沒(méi)有關(guān)于生物堿類(lèi)成分的報(bào)道[11]。

我們用自己建立的α-葡萄糖苷酶模型[12]在篩選糖苷酶抑制成分的過(guò)程中,發(fā)現(xiàn)構(gòu)樹(shù)的提取物有較好的抑制活性。因此,我們對(duì)構(gòu)樹(shù)皮的成分進(jìn)行了分離鑒定,并進(jìn)行了活性測(cè)試。從構(gòu)樹(shù)干燥樹(shù)皮的乙醇提取物中分離得到 6個(gè)化合物,經(jīng)波譜方法鑒定為:broussonetine A(1)、broussonetinine A(2)、broussonetinine B(3)、黑立脂素苷 (liriodendrin,4)、butyrospermyl acetate(5)和胡蘿卜苷(6)。其中化合物 1～3在體外有較強(qiáng)的抑制α-葡萄糖苷酶的作用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

Avance Bruker 600兆核磁共振波譜儀;LCQ型質(zhì)譜儀 (美國(guó) Ther mo-Finnigan公司,配置有 ESI離子源和直接進(jìn)樣注射泵,離子阱質(zhì)量分析器);D72大孔樹(shù)脂 (南開(kāi)大學(xué)樹(shù)脂廠);RP-C18材料 (日本和光純藥公司);硅膠 GF254(青島海浪硅膠干燥劑廠);氧化鋁(上海新誠(chéng)化工有限公司)。

構(gòu)樹(shù) (B roussonetia papyrifera(L.)Vent)皮樣品于 2006年 5月采自重慶市開(kāi)縣巫山鄉(xiāng),由中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所包維楷研究員鑒定。標(biāo)本保存在成都生物研究所標(biāo)本室。

1.2 提取分離

干燥構(gòu)樹(shù)皮 16 kg粉碎后,用 95%乙醇冷浸 4次,每次 7 d,合并提取液,減壓濃縮得油狀浸膏 1.3 kg。浸膏冷卻后析出淺黃色固體 1.4 g。其余浸膏用 2000 mL蒸餾水超聲分散,1000 mL氯仿反復(fù)萃取4次,水相稀釋到5000 mL后,通過(guò)D72大孔樹(shù)脂柱(30×5 cm)。用 10 L水,2.5 L乙醇,3 L 5%的氨-乙醇溶液依次洗脫,氨-乙醇洗脫液濃縮,得到固體物 7.7 g。取 3.6 g樣品進(jìn)行氧化鋁 (100～200目)柱層析(氯仿-甲醇 =15∶1～1∶1梯度洗脫),硅膠(200～300目)柱層析(氯仿-甲醇 =10∶1～1∶1梯度洗脫)和 C18反相柱層析 (10%～40%甲醇水溶液梯度洗脫),得到化合物 1(316 mg)、2(314 mg)、3 (50 mg)和 4(48 mg)。取 0.9 g浸膏中析出的固體,甲醇溶解后拌入 1.2 g硅膠,用 200～300目硅膠經(jīng)柱層析(石油醚-乙酸乙酯 =20∶1梯度洗脫)得化合物 5(418 mg)。氯仿萃取物減壓濃縮蒸干, 1000 mL甲醇溶解,500 mL石油醚反復(fù)萃取 4次,甲醇層 36.2 g拌樣上硅膠柱 (石油醚-乙酸乙酯 =1∶2～1∶4梯度洗脫)分離得到一個(gè)固體,用甲醇結(jié)晶,得到化合物 6(566 mg)。

2 鑒定

化合物 1 白色粉末,mp.154～156℃,茚三酮顯黃色,ESI-MSm/z508[M+H]+,1H NMR(pyridine-d5,600 MHz)δ:3.78(1H,m,H-2),4.83(1H, t,J=4 Hz,H-3),4.10(1H,m,H-4),3.73(1H,m, H-5),2.00(2H,m,H-1′),1.10-1.59(12H,m,H2′-H7′),1.60(2H,m,H-8′),2.49(2H,t,J=7.6 Hz, H-9′),2.76(2H,t,J=7.6 Hz,H-11′),2.16(2H, quintet,J=7.5 Hz,H-12′),3.96(2H,t,J=6.3 Hz, H-13′),4.30(2H,m,CH2OH),5.08(1H,d,J= 7.8Hz,H-1′′),4.10(1H,m,H-2′′),4.40(1H,m,H-3′′),4.15(1H,m,H-4′′),4.44(1H,m,H-5′′),4.60 (2H,m,H-6′′);13C NMR(pyridine-d5,150 MHz)δ: 61.5(C-2),73.3(C-3),88.9(C-4),59.8(C-5), 35.4(C-1′),29.5(C-2′),29.5(C-3′),29.6(C-4′), 29.7(C-5′),29.9(C-6′),27.4(C-7′),24.0(C-8′), 42.6(C-9′),210.7(C-10′),39.3(C-11′),27.6(C-12′),61.1(C-13′),62.3(CH2OH),105.3(C-1′′), 74.7(C-2′′),78.1(C-3′′),71.2(C-4′′),78.3(C-5′′),62.3(C-6′′),以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[4]報(bào)道數(shù)據(jù)一致,故鑒定為 broussonetine A。

化合物 2 白色粉末,茚三酮顯黃色,ESI-MS m/z346([M+H]+),1H NMR (pyridine-d5,600 MHz)δ:3.83(1H,m,H-2),4.67(1H,br.s,H-3), 4.18(1H,m,H-4),3.64(1H,m,H-5),1.85,1.62 (2H,m,H-1′),1.08～1.58(12H,m,H-2′～H-7′), 1.56(2H,m,H-8′),2.37(2H,t,J=7.5 Hz,H-9′), 2.63(2H,t,J=7.2Hz,H-11′),2.03(2H,quintet,J =7.5 Hz,H-12′),3.92(2H,br.s,H-13′),4.27, 4.22(2H,br,CH2OH)。氫譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[4]報(bào)道數(shù)據(jù)一致,故鑒定為 broussonetinine A。

化合物 3 白色粉末,茚三酮顯黃色,ESI-MS m/z346([M+H]+),1H NMR (pyridine-d5,600 MHz)δ:3.85(1H,m,H-2),4.67(1H,br.s,H-3), 4.20(1H,m,H-4),3.56(1H,m,H-5),1.85,1.62 (2H,m,H-1′),1.08～1.58(12H,m,H-2′～H-6′), 1.56(2H,m,H-7′),2.31(2H,t,J=7.5 Hz,H-8′), 2.43(2H,t,J=7.2 Hz,H-10′),1.84(2H,quintet,J =7.5 Hz,H-11′),1.70(2H,quintet,J=7.5 Hz,H-12′),3.92(2H,br.s,H-13′),4.42(2H,br, CH2OH)。氫譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[4]報(bào)道數(shù)據(jù)一致,故鑒定為 broussonetinine B。

化合物 4 無(wú)色針晶 (吡啶),mp.265～266℃。UV(H2O)nm:272,226;I R(KBr)cm-1:3400 (OH),1600,1505;由氫譜、碳譜和質(zhì)譜推測(cè)該化合物為具有對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)的糖苷。1H NMR(DMSO-d6,600 MHz)δ6.66處出現(xiàn) 1個(gè)單峰,為苯環(huán)上的 4個(gè)芳香氫信號(hào),4.66(2H,d,J=3.8 Hz,H-2,6),4.21 (2H,m,H-4,8),3.83(2H,m,H-4,8),3.14(2H, m,H-1,5),3.76處出現(xiàn)的單峰為苯環(huán)上的甲基氫信號(hào),此外,δ4.87處出現(xiàn)的氫信號(hào)為葡萄糖上的端基氫,δ3.09～3.62處出現(xiàn)一系列多重峰,歸屬為葡萄糖上的其他氫信號(hào)。13C NMR(DMSO-d6,150 MHz)δ:152.6(C-3′),137.1(C-4′),133.8(C-1′),104.3(C-2′),102.7(C-1′′),85.0(C-2,6), 77.1(C-5′′),76.5(C-3′′),74.1(C-2′′),71.3(C-4,8),69.9(C-4′′),60.9(C-6′′),56.4(OCH3), 53.5(C-1,5);ESI-MSm/z:765[M+Na]+,603 [M– glc+Na]+,441[M– glc– glc+Na]+。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道一致,故鑒定為黑立脂素苷(liriodendrin)。

化合物 5 白色針晶 (乙酸乙酯),C32H52O2, mp.136～138℃。 IR (KBr)cm-1(max):2932 (OH),1741(C=O),1460,1362;1H NMR(CDCl3, 600 MHz)δ:5.25(1H,d,J=2.9 Hz,H-7),5.10 (1H,brt,J=7.0 Hz,H-24),4.52(1H,dd,J= 10.5,4.4 Hz,H-3),0.97(3H,s,H-30),0.93(3H, s,H-29),0.85(3H,d,J=5.6 Hz,H-21),0.85 (3H,s,H-28),0.80(1H,s,H-18),0.77(1H,s,H-19);13C NMR(CDCl3,150 MHz)δ:171.0(C=O), 146.0(C-8),130.9(C-25),125.1(C-24),117.6 (C-7),81.1(C-3),53.2(C-17),51.3(C-14), 50.8(C-5),48.8(C-9),43.5(C-13),37.8(C-4), 36.8(C-1),35.8(C-20),35.2(C-22),34.8(C-10),33.9(C-15),33.8(C-12),28.4(C-16),27.6 (C-28),27.3(C-30),25.7(C-26),25.3(C-23), 24.2 (C-2),23.8 (C-6),22.0 (C-18),21.3 (COCH3),18.6(C-21),18.1(C-11),17.7(C-17),15.9(C-29),13.1(C-19)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道一致,故化合物 5被鑒定為 butyrospermyl acetate。

化合物 6 白色粉末(甲醇),mp.285～287℃。Liebermann-Burchard反應(yīng)陽(yáng)性,Molish反應(yīng)陽(yáng)性,香草醛-濃硫酸顯紫紅色。與胡蘿卜苷標(biāo)準(zhǔn)品 TLC的Rf值一致。故化合物 6被鑒定為胡蘿卜苷 (daucosterol)。

多羥基生物堿類(lèi)化合物是一類(lèi)具有顯著抑制葡萄糖苷酶活性的化合物[15]。對(duì)本次研究中所分離得到的化合物 1～6進(jìn)行了體外α-葡萄糖苷酶抑制活性篩選,采用經(jīng)典的大鼠小腸外翻囊蔗糖吸收抑制試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)化合物 1～3在體外有較強(qiáng)的抑制α-葡萄糖苷酶的作用,其 IC50分別為 0.530、0.445和0.460 mg/mL。

α-葡萄糖苷酶抑制劑可用于治療糖尿病、肥胖癥以及病毒性感冒。構(gòu)樹(shù)生長(zhǎng)容易,我國(guó)的資源豐富,闡明其具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的成分將為有效利用這類(lèi)自然資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 China Pharmaceutical University(中國(guó)藥科大學(xué)).CollectionWords of ChineseMateriaMedica(中藥辭海),Vol.2, Beijing:ChinaMedico-Pharmacological Science and Technology Publishing House,1996.695,

2 Shibano M,Kitagawa S,Kusano G,Studies on the constituents ofB roussonetiaspecies.I.Two new pyrrolidine alkaloids,broussonetines C and D,asβ-galactosidase andβ-mannosidase inhibitors fromB roussonetia kazinokiSieb.Chem Phar m Bull,1997,45:505-508.

3 Shibano M,Kitagawa S,Nakamura S,et al.Studies on t he constituent s ofB roussonetiaspecies.Ⅱ.Six new pyrrolidine alkaloids,broussonetine A,B,E,F and broussonetinine A and B,as inhibitors of glycosidases fromB roussonetia kazinokiSieb.Chem Phar m Bull,1997,45:700-705.

4 Shibano M,Nakamura S,Akazawa N,et al.Studies on the constituents ofBroussonetia species.III.Two new pyrrolidine alkaloids,broussonetines G and H,as inhibitors of glycosidase,fromB roussonetia kazinokiSieb.Chem Phar m Bull, 1998,46:1048-1050.

5 ShibanoM,Nakamura S,KuboriM,et al.Studies on the constituentsofBroussonetia species. IV.Two new pyrrolidinylpiperidine alkaloids,roussonetines I and J,fromB roussonetia kazinokiSieb.Chem Phar m Bull,1998,46:1416-1420.

6 ShibanoM,Nakamura S,Motoya N,et al.Studies on the constituents ofBroussonetia species.V.Two new pyrrolidine alkaloids,broussonetines K and L,as inhibitors of glycosidase, fromB roussonetia kazinokiSieb.Chem Phar m Bull,1999,47: 472-476.

7 ShibanoM,Tsukamoto D,Kusano G.A new pyrrolizidine alkaloid,broussonetine N,as an inhibitor of glycosidase,from B roussonetia kazinokiSieb.and absolute stereost ructures of broussonetinesA and B.Chem Phar m Bull,1999,47:907-908.

8 Shibano M,Tsukamoto D,Fujimoto R,et al.Studies on t he constituent s ofB roussonetiaspecies.V II.Four new pyrrolidine alkaloids,broussonetinesM,O,P,and Q,as inhibitorsof glycosidase,fromB roussonetia kazinokiSieb.Chem Phar m Bull,2000,48:1281-1285.

9 Tsukamoto D,Shibano M,Okamoto R,et al.Studies on the constituents ofBroussonetia speciesⅧ,Four new pyrrolidine alkaloids,broussonetines R,S,T,and V and a new pyrroline alkaloid,broussonetine U,fromB roussonetia kazinokiSieb, Chem Phar m Bull,2001,49:492-496.

10 Tsukamoto D,ShibanoM,Kusano G.Studies on the constituents of Broussonetia speciesⅩ.Six new alkaloids from B roussonetia kazinokiSieb.Chem Phar m Bull,2001,49: 1487-1491.

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Chem ical Constituents withα-Glycosidase Inhibiting Activity from the Bark ofB roussonetia papyrifera

BAO Ling1,CU IWen-feng2,YU Jian-ping2,YU Kai3,WANGMing-kui1＊1Key Laboratory of M ountain Ecological Restoration and B ioresource U tilization of CAS,Ecological Restoration and B iodiversity Conservation Key Laboratory of Sichuan Province,Chengdu Institute of B iology,Chinese Academ y of Sciences,Chengdu 610041;2The College of B iology in Guizhou University Gui Yang 550025;3School of Life Science&Engineering,Southwest Jiaotong University,Chengdu610013

Theα-glycosidase inhibitorswere isolated and identified from the bark ofB roussonetia papyrifera.By solvent extraction and column chromatography,six compoundswere isolated from ethanolic extracts of this plant for the first time and identified as broussonetine A(1),broussonetinine A(2),broussonetinine B(3),liriodendrin(4),butyrospermyl acetate(5),and daucosterol(6)by spectral evidence.Activity assay indicated that compounds 1-3 had strong glycosidase inhibiting activitieswith IC50value of 0.530,0.445,and 0.460 mg/mL,respectively.

B roussonetia papyrifera;broussonetine A;broussonetinine A;broussonetinine B;glycosidase inhibitor

1001-6880(2010)06-0934-04

2009-02-11 接受日期:2009-04-01

四川省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目 (2007J13-059)

＊通訊作者 Tel:86-28-85229073;E-mail:wangmk@cib.ac.cn

Q946.91;R284.1

A