東北紅豆杉 (Taxus cuspidata)中四種紫杉烷類(lèi)化合物抑制婦科腫瘤細(xì)胞增殖活性研究及其作用機(jī)制的初步探討

李 珊,馬如飛,王思明,張嫚麗,王于方,董 玫＊,史清文,張紅真

1河北醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,石家莊 050031;2河北醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)系河北省法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石家莊 050017;3河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,石家莊 050017

東北紅豆杉 (Taxus cuspidata)中四種紫杉烷類(lèi)化合物抑制婦科腫瘤細(xì)胞增殖活性研究及其作用機(jī)制的初步探討

李 珊1,馬如飛2,王思明3,張嫚麗3,王于方3,董 玫2＊,史清文3,張紅真1

1河北醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,石家莊 050031;2河北醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)系河北省法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石家莊 050017;3河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,石家莊 050017

通過(guò)四唑鹽(MTT)比色法檢測(cè)東北紅豆杉中四種紫杉烷類(lèi)化合物對(duì)人子宮頸癌細(xì)胞、人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞、人卵巢透明癌細(xì)胞和人卵巢囊腺癌細(xì)胞增殖的影響,不僅探討了這些化合物作用的構(gòu)效關(guān)系,還初步探討了其抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn) 9,10-去乙酰紫杉寧對(duì)人子宮頸癌細(xì)胞、人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞和人卵巢囊腺癌細(xì)胞的增殖均有明顯的抑制作用,與紫杉寧和 1β-羥基紫杉寧即使在 100μmol/L的高濃度下,對(duì)五種婦科腫瘤細(xì)胞的增殖不顯示抑制活性;流式細(xì)胞學(xué)檢查發(fā)現(xiàn) 9,10-去乙酰紫杉寧作用后的 HeLa細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。因此推測(cè):1.C-9,10位的羥基和 C-5位的肉桂?；鶄?cè)鏈?zhǔn)窃擃?lèi)化合物抑制腫瘤細(xì)胞增殖所必需的;2. 9,10-去乙酰紫杉寧有可能是通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)其抑制 HeLa細(xì)胞的增殖作用。

東北紅豆杉;紫杉烷類(lèi)化合物;腫瘤細(xì)胞;增殖活性;細(xì)胞凋亡

紅豆杉(俗稱紫杉,又稱赤柏松,yew)在植物分類(lèi)學(xué)上歸屬于裸子植物亞門(mén) (Gymnospermae),松杉綱 (Coniferopsidae),紅豆杉目 (Taxales),紅豆杉科(Taxaceae),紅豆杉族 (Taxeae)下的紅豆杉屬 (Taxus)。全世界約有 11種,主要分布于北半球,我國(guó)有4種 1變種,主要分布于甘肅、陜區(qū)[1,2],東北紅豆杉為其中的一種。民間用紅豆杉屬植物的果實(shí)和枝葉煎湯用以驅(qū)蟲(chóng)、消積、潤(rùn)燥、利尿消腫、通經(jīng),治療腎臟病、糖尿病、腎炎浮腫、小便不利、淋病、治療月經(jīng)不調(diào)、產(chǎn)后瘀血、痛經(jīng)等并且可以治療多種腸道寄生蟲(chóng)[3-6]。

由于從紅豆杉科紅豆杉屬植物中發(fā)現(xiàn)了紫杉醇這一著名的抗腫瘤天然產(chǎn)物,紅豆杉屬植物成為近30年的研究熱點(diǎn)。隨著近年對(duì)紫杉醇及其前體物的需求量不斷攀升,尋找新的生物資源保護(hù)生態(tài)環(huán)境已迫在眉睫。盡管目前已經(jīng)提取分離得到了大量的紫杉醇類(lèi)似化合物,但迄今為止仍沒(méi)有紫杉醇的第二代藥物上市。本文對(duì)從東北紅豆杉 (Taxus cuspidata)的可再生資源部位小枝和針葉中分離純化得到的四種紫杉烷類(lèi)化合物進(jìn)行抑制 HeLa等人婦科腫瘤細(xì)胞增殖活性研究,并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制,為開(kāi)發(fā)新的治療婦科腫瘤藥物提供理論依據(jù)。

1 材料、試劑與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

試驗(yàn)用細(xì)胞株由日本千葉大學(xué)醫(yī)學(xué)部第二生物化學(xué)教室提供。HeLa:人子宮頸癌細(xì)胞株[7];HEC-1:人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株[8];SH IN3和 HOC-21:人卵巢透明癌細(xì)胞株[8];HAC-2:人卵巢囊腺癌細(xì)胞株[8]。試驗(yàn)用正常細(xì)胞由河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。HELF:人胚肺成纖維細(xì)胞。紫杉烷類(lèi)單體化合物 7-乙酰氧基-5-去桂皮?；仙紝?(taxuspine F,1),紫杉寧 (taxinine,2),1β-羥基紫杉寧 (1β-hydroxyl-taxinine,3)和 9,10-去乙酰紫杉寧 (9,10-deacetyl taxinine,4)由河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室從東北紅豆杉的小枝和針葉中分離得到,經(jīng) 1D-和 2D-NMR等波譜技術(shù)確定其結(jié)構(gòu)如下(見(jiàn)圖 1)。

圖 1 四種紫杉烷類(lèi)化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of 4 non-paclitaxel-type taxoids

1.2 藥品和試劑

MTT為美國(guó) Sigma產(chǎn)品,批號(hào):Lot.T W 074,日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社;SDS為美國(guó) Biotec公司產(chǎn)品;胎牛血清為 G IBCO公司產(chǎn)品;RPM I 1640和胰蛋白酶為 G IBCO公司產(chǎn)品;AnnexinⅤFITC KIT為晶美生物工程有限公司產(chǎn)品;Taxol由河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室提供。

1.3 儀器

生物顯微鏡:OLY MPUS,型號(hào) JAPAN NO: 11058;CO2培養(yǎng)箱:MLO-18 A IL型,三洋電氣公司產(chǎn)品;倒置相差顯微鏡:LH50A型,日本 OLY MPUS產(chǎn)品;超凈工作臺(tái):BHL-1300-2 B型,Airtech Japan;精密電子天平 (分度值 0.01 mg):L IBROR AEL-40 S M No.04001003,SH IMADZU CORPORAT ION;80-2低速離心機(jī):江蘇富化儀器有限公司;YXQG 02式蒸汽消毒鍋:山東新華醫(yī)療器械有限公司;DHX-9243B型(101-3 B)電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;酶標(biāo)儀:S/N:E 11325型為美國(guó)Precision microplate reader公司產(chǎn)品;光學(xué)顯微鏡:日本OLY MPUS生產(chǎn);培養(yǎng)板:美國(guó) Costar公司產(chǎn)品;流式細(xì)胞儀:FACSCalibur型為美國(guó) Becton Dickinson公司產(chǎn)品。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 腫瘤細(xì)胞株懸液制備[9]

用 RPM I1640完全培養(yǎng)液將被試腫瘤細(xì)胞株調(diào)整濃度為 2×105個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液備用。

2.2 實(shí)驗(yàn)用化合物的體外抑瘤實(shí)驗(yàn)[10]

將被試腫瘤細(xì)胞株懸液接種于 96孔培養(yǎng)板,每孔 50μL(含 1×104個(gè)細(xì)胞),分別加入空白對(duì)照磷酸鹽緩沖液、溶劑對(duì)照(終濃度 0.5%DMSO)、陽(yáng)性對(duì)照紫杉醇以及終濃度為1μmol/L、10μmol/L、100 μmol/L的化合物 1～4各 50μL,每組均設(shè) 3個(gè)復(fù)孔。置于飽和濕度、37℃和 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,于培養(yǎng)結(jié)束前 4 h,各培養(yǎng)孔加入 5 mg/mL四甲基偶氮唑藍(lán) (MTT)10μL。培養(yǎng)結(jié)束后,棄去培養(yǎng)上清,每孔加入反應(yīng)停止液 150μL,振蕩 10 min,使結(jié)晶充分溶解,用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)各孔吸光度(OD)值,測(cè)定波長(zhǎng)λ=570 nm,參考波長(zhǎng)λ= 630 nm,并計(jì)算腫瘤細(xì)胞生存率。

腫瘤細(xì)胞生存率 (CS)%=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%

2.3 流式細(xì)胞儀及AnnexinⅤ-FITC試劑盒分析細(xì)胞凋亡

按左連富等[11]方法。HeLa細(xì)胞傳代進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,隨機(jī)分組,實(shí)驗(yàn)組加入 50μmol/L的 9,10-去乙酰紫杉寧,空白對(duì)照組加入磷酸鹽緩沖液,于培養(yǎng) 48 h后收集細(xì)胞,用 4℃預(yù)冷的 PBS洗細(xì)胞兩次,用 250μL結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞,調(diào)整其濃度為 1×106/mL,取 100μL的細(xì)胞懸液于 5 mL流式管中,加入 5μL AnnexinⅤ/FITC和 10μL 20 μg/mL的 PI溶液,混勻后于室溫避光孵育 15 min,在反應(yīng)管中加 400μL稀釋好的結(jié)合緩沖液,及時(shí)上流式細(xì)胞儀分析。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 化合物 1～4對(duì)體外培養(yǎng)的 HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用

結(jié)果如圖 2所示,陽(yáng)性對(duì)照紫杉醇顯示強(qiáng)的抑制人子宮頸癌細(xì)胞 (HeLa)增殖活性的作用,用 1 μmol/L、10μmol/L和 100μmol/L的紫杉醇處理HeLa細(xì)胞,其腫瘤細(xì)胞生存率分別為 28.34%、22.82%和 15.23%;而 7-乙酰氧基-5-去桂皮?；仙紝?(1)即使用 100μmol/L處理 HeLa細(xì)胞,其腫瘤細(xì)胞生存率仍為 100%,對(duì) HeLa細(xì)胞的增殖不顯示任何抑制活性;當(dāng)用 100μmol/L的與化合物 1母核結(jié)構(gòu)相同,在 5位碳原子上連接脂溶性的肉桂?；鶄?cè)鏈的化合物2、3和4處理HeLa細(xì)胞,其腫瘤細(xì)胞生存率分別為下降為 65.48%,51.27%和26.93%,并且與空白對(duì)照組相比較具有非常顯著性差異。通過(guò)腫瘤細(xì)胞生存率和化合物 4濃度的對(duì)數(shù)回歸方程 y=-12.595 Ln(x)+87.333,得到化合物 4對(duì) HeLa細(xì)胞增殖的半數(shù)抑制濃度 (IC50)僅為19.38μmol/L。

3.2 化合物 1～4對(duì)其它四種婦科腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性的影響

試驗(yàn)結(jié)果如表 1所示。陽(yáng)性對(duì)照紫杉醇對(duì)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞 (HEC-1),人卵巢透明癌細(xì)胞株(SH IN3和 HOC-21)和人卵巢囊腺癌細(xì)胞株 (HAC-2)的增殖不顯示任何抑制活性,I C50都大于 100 μmol/L?；衔?3僅對(duì) HAC-2的增殖有較弱的抑制活性,其 I C50為 88.75μmol/L;化合物 4對(duì) HEC-1和 HAC-2的增殖有較強(qiáng)的抑制活性,其 IC50分別為32.04μmol/L和 67.22μmol/L。化合物 1和 2對(duì)四種婦科腫瘤細(xì)胞的增殖均不顯示抑制活性,其I C50都大于 100μmol/L。

3.3 化合物 1～4對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖抑制活性的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖 3所示,陽(yáng)性對(duì)照紫杉醇對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞 (HELF)的增殖呈現(xiàn)較強(qiáng)的抑制活性,IC50為 8.77μmol/L,化合物 1僅在 100μmol/L劑量組顯示較低的細(xì)胞增殖抑制活性,其細(xì)胞增殖生存率為 70.43%,C-5位具有肉桂?；钠渌N試驗(yàn)用化合物 2～4對(duì) HELF細(xì)胞的增殖不顯示抑制活性,三種被試化合物的 IC50均大于 100μmol/L。

圖 2 四種紫杉烷類(lèi)化合物對(duì)人宮頸癌細(xì)胞增殖的影響Fig.2 The effect of four non-paclitaxel-type taxoids on the proliferation of HeLa tumor cell line

表 1 四種紫杉烷類(lèi)化合物對(duì)四種婦科腫瘤細(xì)胞增殖活性的影響Table 1 The effect of three sesquiterpene lactones on the proliferation of other tumor cell line

圖 3 四種紫杉烷類(lèi)化合物對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖的影響Fig.3 The effect of four non-paclitaxel-type taxoids on the proliferation of Human embryonic lung fibroblast

3.4 AnnexinⅤ-FIFC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果

9,10-去乙酰紫杉寧 (4)以 50μmol/L處理 He-La細(xì)胞,于 48 h后進(jìn)行Annexin-Ⅴ/PI染色,流式細(xì)胞儀檢測(cè),結(jié)果顯示 HeLa細(xì)胞早期凋亡率為(48.51±6.84)%,PBS組為 (3.47±3.82)%,9, 10-去乙酰紫杉寧 50μmol/L濃度組與 PBS組相比,具有顯著性差異 (P<0.05)。流式細(xì)胞檢測(cè)提示9,10-去乙酰紫杉寧具有明顯誘導(dǎo) HeLa細(xì)胞凋亡的活性 (圖4)。

圖 4 9,10-Deacetyl taxinine對(duì) HeLa細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 The effect of 9,10-deacetyl taxinine on apoptosis of HeLa cell line

4 討論

癌癥是威脅人類(lèi)健康的一大兇手,是僅次于心腦血管疾病的第二大致死性疾病,嚴(yán)重地威脅人類(lèi)的健康和生命,婦科腫瘤又是臨床最常見(jiàn)的惡性腫瘤,手術(shù)和放療是婦科腫瘤常用的治療手段,療效肯定,但是中、晚期患者的治療效果迄今仍較差,5年生存率徘徊在 50%左右。現(xiàn)在臨床上應(yīng)用的抗癌藥物雖然種類(lèi)不少,但價(jià)格昂貴,毒副作用嚴(yán)重,且尚沒(méi)有治療某些癌癥的特效藥。因此尋找療效確切,作用機(jī)理清楚,治愈率高,毒副作用小的抗癌藥物,攻克癌癥成為全世界醫(yī)藥工作者亟待解決的一大課題。植物在其漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中合成了許許多多結(jié)構(gòu)各異的次生代謝天然產(chǎn)物,這些次生代謝產(chǎn)物不僅具有不同的生物活性,還常常被發(fā)現(xiàn)有新的作用機(jī)制,象紫杉醇 (Taxol)、長(zhǎng)春新堿 (Vincristine, VCR)、喜樹(shù)堿 (Camptothecin,CPT)就是從植物中發(fā)現(xiàn)的三個(gè)優(yōu)秀的天然抗癌藥物中的代表,但彼此具有三個(gè)不同的甚至完全相反的抗癌作用機(jī)制,這些天然藥物的發(fā)現(xiàn)和在臨床上的廣泛應(yīng)用,極大地推動(dòng)了化學(xué)家和藥學(xué)家對(duì)抗癌藥物的研發(fā)[12,13]。

東北紅豆杉 (Taxus cuspidate)主產(chǎn)我國(guó)黑龍江省南部和吉林、遼寧等省,資源豐富,目前從東北紅豆杉中提取分離得到的 130多種紫杉二萜類(lèi)化合物,其中一些化合物顯示了較好的抗腫瘤、抗炎、抗病毒等生物活性,非紫杉醇類(lèi)紫杉烷類(lèi)化合物如taxuspine D、taxezopidine K和 taxagifine顯示出對(duì)CaCl2誘導(dǎo)的微管解聚作用有效的抑制活性[14-18]。紫杉烷二萜類(lèi)制劑除紫杉醇外,還有泰索帝 (docetaxel)等,既可單獨(dú)應(yīng)用,又可與順鉑、卡鉑等化療藥物聯(lián)合使用。另外,王建華等[19]對(duì)從東北紅豆杉中分離得到的 3種紫杉烷類(lèi)化合物 2,9-diacetyl-5-cinnamoyl-phototaxicin II、5-acetyltaxuspineW 及 10-acetyltaxuspineB進(jìn)行抗癌活性研究,發(fā)現(xiàn) 3個(gè)化合物對(duì)人乳腺癌細(xì)胞的增值均有明顯的抑制作用。

本實(shí)驗(yàn)利用體外細(xì)胞培養(yǎng)方法,觀察了東北紅豆杉中 4種紫杉醇類(lèi)單體化合物對(duì)人子宮頸癌細(xì)胞,人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞,人卵巢透明癌細(xì)胞和人卵巢囊腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這 4種化合物中 9,10-去乙酰紫杉寧對(duì) HeLa細(xì)胞、HEC-1細(xì)胞和 HAC-2細(xì)胞均有較強(qiáng)的抑制活性,其半數(shù)抑制濃度 (IC50)分別為 19.38μmol/L,32.04μmol/L和 67.22μmol/L,但四種化合物對(duì)于正常的細(xì)胞,即人胚肺成纖維細(xì)胞的增殖不呈現(xiàn)抑制活性。4個(gè)化合物均為 6/8/6三環(huán)紫杉烷類(lèi)且 C-13位均含有羰基,化合物 2～4在 C-5位具有肉桂酰基,化合物2和 3在 C-9和 C-10位均是乙?；?而化合物 4在C-9和 C-10位均是游離的羥基;化合物 1在 C-5位沒(méi)有肉桂?；《氖且粋€(gè)游離的羥基。由此我們推測(cè) C-9,10位的羥基和 C-5位的肉桂酰基是該類(lèi)化合物抑制腫瘤細(xì)胞增殖所必需的。

細(xì)胞凋亡又稱程序性細(xì)胞死亡 (programmed cell death,PCD),是在一定的生理和病理情況下如細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的變化或死亡信號(hào)觸發(fā)等,機(jī)體為維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,通過(guò)基因調(diào)控而使細(xì)胞主動(dòng)死亡的過(guò)程。隨著腫瘤分子生物學(xué)研究的深入,人們認(rèn)識(shí)到腫瘤的發(fā)生和發(fā)展不僅與腫瘤細(xì)胞的增殖分化異常有關(guān),而且同細(xì)胞凋亡的調(diào)控失常有關(guān)。腫瘤化療的目標(biāo)就是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。目前臨床上使用的大多數(shù)抗腫瘤藥物可誘導(dǎo)敏感腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡,其抗腫瘤效能與腫瘤細(xì)胞在藥物誘導(dǎo)下發(fā)生細(xì)胞凋亡的內(nèi)在活性有關(guān)[20]。為了進(jìn)一步探討東北紅豆杉中單體化合物 9,10-去乙酰紫杉寧抑制 HeLa細(xì)胞增殖作用的機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)利用 AnnexinⅤ-FIFC/ PI染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)法測(cè)定了 7-乙酰氧基-5-去桂皮?；仙紝幷T導(dǎo) HeLa細(xì)胞的凋亡活性,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,9,10-去乙酰紫杉寧以 50μmol/L處理HeLa細(xì)胞 48 h后,HeLa細(xì)胞早期凋亡率為 (48.51 ±6.84)%,與 PBS組相比,具有顯著性差異 (P< 0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示東北紅豆杉中單體化合物 9, 10-去乙酰紫杉寧抑制 HeLa細(xì)胞增殖作用可能是通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)的。我們還將繼續(xù)對(duì)該類(lèi)化合物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制進(jìn)行深入的研究,尤其是通過(guò)哪些基因誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡方面,并著手臨床應(yīng)用的探索。

致謝:國(guó)家自然科學(xué)基金(8107255)的資助。

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Anti-proliferation Activity aga inst Tumor Cells of Non-paclitaxel-type Taxoids fromTaxus cuspidateand itsM echan ism

L I Shan1,MA Ru-fei2,WANG Si-ming3,ZHANGMan-li3, WANG Yu-fang3,DONGMei2＊,SH IQing-wen3,ZHANG Hong-zhen11The First Affiliated Hospital of HebeiM edical Uninversity,Shijiazhuang 050031,China;2Departm ent of ForensicM edicine,HebeiM edical Univercity,Shijiazhuang 050017,China;3Depar tm ent of M edicinal Natural Product Chem istry,School of Phar m aceutical Sciences,HebeiM edical University,Shijiazhuang 050017,China

Four non-paclitaxel-type taxoids taxuspine(1),taxinine(2),1β-hydroxyl-taxinine(3),and 9,10-deacetyl taxinine(4)were isolated fromTaxus cuspidata.Their anti-proliferation effects on the cell lines of HeLa,HEC-1, SH IN3,HOC-21,and HAC-2 were evaluated by usingMTT assay.In addition,the structure activity relationship and the possible mechanism were discussed.The results showed that only compound 4 exhibited significant anti-proliferation activities against HeLa,HEC-1,and HAC-2 cell lines and 9,10-hydroxyl and 5-cinnamoyl group were essential for the activity.Furthermore,the apoptosis induced by 9 in Hela cellwas studied by Flow Cytometry(FCM),which indicated that the anti-proliferation activity of 9,10-deacetyl taxinine was achieved by inducing HeLa cell apoptosis probably.

Taxus cuspidata;non-paclitaxel-type taxoids;human tumor cell lines;anti-proliferation activity;apoptosis

1001-6880(2010)06-1109-05

2009-05-14 接受日期:2010-07-07

國(guó)家自然科學(xué)基金(8107255)

＊通訊作者 Tel:86-311-8626-5602;E-mail:meidong@hebmu.edu.cn

R914;R284.3;Q946.91

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