血水草生物堿對釘螺足跖平滑肌mAChR的作用

廖鑫鑫，黃 勝，楊華中，黃瓊瑤，彭 飛，劉年猛，孫 慧

（1.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院05級醫(yī)療專業(yè)學(xué)生；2.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室；3.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室，湖南 長沙 410006）

血水草（Eomecon chionantha Hance）系罌粟科植物血水草屬[1]。從其根莖中提取的ECA，在研究殺螺植物時，發(fā)現(xiàn)有殺滅釘螺、降低釘螺附壁上爬率的作用[2-4]。有文獻(xiàn)報道[7]，乙酰膽堿(acetylcholine, ACh)是湖北釘螺足跖平滑肌的興奮性遞質(zhì)，在釘螺的足部肌肉中存在膽堿能受體 (acetylcholine receptors,AChR)。為闡明ECA的作用機(jī)制，本實驗采用離體釘螺足跖平滑肌標(biāo)本，探討ECA對其收縮的影響及與mAChR的關(guān)系，為進(jìn)一步研究和開發(fā)該藥提供藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 釘螺

湖北釘螺（Oncomelania hupensis）為試驗前2～3天從岳陽君山采集置實驗室飼養(yǎng)。選取成熟 （螺齡7～8旋）、活動能力強(qiáng)的釘螺進(jìn)行試驗，雌雄兼用。

1.2 藥品

ECA由本實驗室提取制備[5]。臨用時，用Ringer's液溶解、稀釋成所需濃度。Ringer's液的組成（mmol/ L）：NaCl 115.60，KCl 1.20，CaCl21.05，NaHCO32.68，NaH2PO40.054。用雙蒸水配制，PH 7.6。Atropine sulphate，Sigma公司產(chǎn)品。不同濃度的實驗藥物均采用等容量給藥法，0.1mL/次，加在10mL標(biāo)本槽內(nèi)。

1.3 儀器

BL-420E+生物信號采集處理系統(tǒng)(成都泰盟)、微張力換能器（10g，JH-2A，航天醫(yī)學(xué)工程研究所)、雙目解剖顯微鏡（ASOM-4，成都科奧）。

1.4 離體釘螺足跖平滑肌的制備

取健康釘螺1只，按李氏破螺法破螺[6]，將釘螺置于通入混合氣體（95%O2+5%CO2）的Ringer's液的培養(yǎng)皿中，在雙目解剖顯微鏡下分離足跖平滑肌，用自制的兩個不銹鋼小鉤分別固定足跖平滑肌前、后處，其中通過一小鉤端固定在標(biāo)本板上，移入盛有10mL Ringer's液的恒溫浴槽中，持續(xù)通入混合氣體，溫度20～25℃；另一個小鉤端通過連線與張力傳感器相連，用BL-420E+生物信號采集處理系統(tǒng)實時記錄試驗全過程，觀察和記錄足跖平滑肌的張力、收縮幅度及頻率的變化情況。

1.5 ECA對離體釘螺足跖平滑肌的自發(fā)性收縮的影響實驗

實驗設(shè)計為用藥（ECA）前后的對比，用藥前給予與實驗組等量的Ringer's液作對照，實驗組設(shè)3個濃度（5.0mg、10.0mg、20.0 mg/L ECA）。實驗前，預(yù)先給浴槽中的足跖平滑肌標(biāo)本500mg負(fù)荷，平衡1.5h，平衡期間不斷調(diào)整其靜息張力，使基線處在一個穩(wěn)定的狀態(tài)，每隔15min更換一次營養(yǎng)液，基線穩(wěn)定后開始實驗。記錄一段正常曲線后，再用微量注射器抽取對應(yīng)濃度的藥物（0.1mL/次）加入浴槽中，然后觀察注入藥物后足跖平滑肌的張力收縮幅度及頻率的情況。各標(biāo)本在進(jìn)行下步實驗前，需用Ringer's液沖洗5次，使曲線回到基線后，平衡30分鐘，待其恢復(fù)正常，才能進(jìn)行下步操作。每組10個標(biāo)本。

1.6 ECA對釘螺足跖平滑肌

mAChR的影響實驗 實驗條件同前。記錄一段正常的曲線后，加入20.0 mg/L ECA，記錄收縮曲線。沖洗、平衡，待曲線恢復(fù)正常并穩(wěn)定后進(jìn)行阿托品的干預(yù)實驗：加入2×10－6mol/L或6×10－6mol/L阿托品，5min后再加入20.0 mg/L ECA，記錄收縮曲線。共測試10例標(biāo)本。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗結(jié)果以mean±s表示，組間差異用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 ECA對釘螺足跖平滑肌自發(fā)性收縮活動的影響

3種濃度的ECA均能使釘螺足跖平滑肌收縮曲線的基線上移，肌張力增加；收縮幅度減小，收縮頻率加快。且呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系（見表1）。

2.2 ECA對釘螺足跖平滑肌mAChR的影響

2×106阿托品可明顯地降低由ECA所至的釘螺足跖平滑肌張力，但不能有效影響其收縮幅度及收縮頻率；6×10-6mol/L阿托品明顯地抑制由ECA所至的釘螺足跖平滑肌張力及收縮幅度，而對收縮頻率仍無顯著影響（見表2）。

表1 ECA對釘螺足跖平滑肌自發(fā)性收縮的影響（mean±S，n=10）

表2 血水草生物堿對釘螺足跖平滑肌mAChR的影響（mean±S，n=10）

3 討論

根據(jù)對釘螺足跖肌形態(tài)學(xué)的研究，其足跖肌屬于平滑肌[6]。其上存在AChR，ACh是其興奮性遞質(zhì)[7]。AChR興奮可致平滑肌細(xì)胞跨膜Ca2+移動的增加，細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加，引起肌肉收縮[8]。AchR有mAChR和煙堿型乙酰膽堿受體 (nicotinic acetylcholinereceptors，nAChR)二類。平滑肌細(xì)胞上主要為mAChR。刺激mAChR-M3能有效地排盡內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+庫，迅速引起細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度提高；同時引起Ca2+跨過細(xì)胞膜內(nèi)流，而導(dǎo)致平滑肌收縮[9]。先前的實驗證實，ECA對釘螺足跖平滑肌的興奮作用與ECA促外Ca2+內(nèi)流和促內(nèi)Ca2+釋放有關(guān)[10]。本實驗采用離體試驗方法，探討ECA興奮釘螺足跖平滑肌作用是否與mAChR介導(dǎo)有關(guān)，結(jié)果表明：ECA能顯著地使釘螺足跖平滑肌張力增加、收縮幅度減小，收縮頻率加快，且有明顯的量效關(guān)系，此結(jié)果與以往報道一致[10]；小劑量阿托品（2×10-6mol/L）可明顯地降低由ECA所至的釘螺足跖平滑肌張力，但不能有效影響其收縮幅度及收縮頻率；大劑量阿托品（6×10-6mol/L）既能明顯地抑制ECA所致的釘螺足跖平滑肌張力，也能有效地降低其收縮幅度，但對其收縮頻率仍無顯著影響。阿托品為mAChR的阻斷劑，可選擇性的阻斷mAChR激動劑對該受體的激動作用，從而使該受體的生物效應(yīng)或藥理效應(yīng)降低。從上述實驗結(jié)果來看，大、小劑量的阿托品，均能拮抗ECA興奮釘螺足跖平滑肌作用，提示ECA的此種興奮作用與mAChR介導(dǎo)有關(guān)；釘螺足跖平滑肌上存在mAChR。至于不同的劑量的阿托品對ECA拮抗作用的差異，本人認(rèn)為主要是由于mAChR阻斷劑阿托品的量效關(guān)系所致。小劑量的阿托品對mAChR的阻斷不完全，而大劑量阿托品阻斷作用較完全。值得注意的是：大、小劑量的阿托品均對ECA所致的收縮的頻率無明顯影響，這可能是由于ECA興奮平滑肌作用與多種因素介導(dǎo)有關(guān)，而非僅由mAChR介導(dǎo)所致。

綜上分析，釘螺足跖平滑肌上存在有mAChR；ECA興奮釘螺足跖平滑肌，導(dǎo)致其緊張性收縮或痙攣性麻痹的作用部分是由mAChR介導(dǎo)的，并可能通過激活ROCC，促外Ca2+內(nèi)流和促內(nèi)Ca2+釋放引起。

[1]吳征鎰.新華本草綱要[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 1988.238.

[2]劉年猛,彭飛,黃瓊瑤,等.血水草生物堿滅釘螺的初步探討[J].中國血吸蟲病防治雜志，2001，13(5):303-304.

[3]黃瓊瑤，彭飛,劉年猛，等.血水草生物堿殺滅釘螺的研究[J].中國血吸蟲病防治雜志,2004,16(1):55-57.

[4]彭飛，黃瓊瑤，劉年猛,等.血水草生物堿實驗室和現(xiàn)場殺滅釘螺的效果觀察[J].中國熱帶醫(yī)學(xué),2003,3(4):435-437.

[5]楊華中,黃瓊瑤,劉年猛,等.血水草殺螺成分-血水草生物堿((ECA)的提取[J].中國血吸蟲病防治雜志,2003,5(6):450-451.

[6]李賦京.釘螺解剖與比較解剖[M].武漢:湖北人民出版社[M].1956.1-44.

[7]耿輝,夏國瑾,何昌浩.檳榔堿對湖北釘螺足肌膽堿能受體的作用[J].中國血吸蟲病防治雜志,1999.11(5):281.

[8]Cardenes HL,Ross DH.Calcium depletion of synaptosomes after morphine treatment,Br J Pharmacology,1976，57(4): 521-526.

[9]Berridge MJ,Irvine RF.Inositol.phosphates and cell signalling[J].Nature，1989,341(6239):197-205.

[10]楊華中，彭飛，劉年猛，等.血水草生物堿對離體釘螺足跖平滑肌收縮的影響及與Ca2+的關(guān)系[J].中國血吸蟲病防治雜志,2005.17(6):427-429.