雙參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢測Molt-4和Jurkat細(xì)胞膜受體途徑凋亡的始動(dòng)位點(diǎn)*

楊長永,陳傳波,陶德定,黃 丹,龔建平

1)河南大學(xué)公共衛(wèi)生研究所開封 475004 2)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院腫瘤研究所武漢 430030△男,1978年生,碩士,講師,研究方向:腫瘤分子生物學(xué),E-mail:yangchangyong52@yahoo.com.cn

細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞周期事件[1]。細(xì)胞凋亡的細(xì)胞周期特異性即是處于不同細(xì)胞周期時(shí)相的細(xì)胞同時(shí)受到同樣的“打擊”,細(xì)胞均在細(xì)胞周期中的某一特定點(diǎn)走向凋亡[2]。細(xì)胞凋亡的途徑主要有 2條:一條是通過線粒體釋放凋亡酶激活因子激活Caspase;另一條是通過胞外信號(hào)激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡酶Caspase,即膜受體途徑。活化的Caspase可將細(xì)胞內(nèi)的重要蛋白降解,引起細(xì)胞凋亡。腫瘤壞死因子α(TNF-α)是典型的膜受體途徑的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑。該實(shí)驗(yàn)中作者采用TNF-α誘導(dǎo)不同細(xì)胞凋亡,建立合理、穩(wěn)定的膜受體途徑的凋亡模型,并通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的周期特異性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑 T淋巴細(xì)胞型白血病細(xì)胞株Molt-4與Jurkat購自武漢大學(xué)典型物保藏中心,外周血淋巴細(xì)胞(PBL)取自健康志愿者,均知情同意。異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)與植物血凝素(PHA)購自晶美公司, TNF-α為英國 EC公司產(chǎn)品,淋巴細(xì)胞分離液為中科院血液所產(chǎn)品,FACSort流式細(xì)胞儀為美國BD公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) Molt-4與Jurkat細(xì)胞接種于體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 kU/L青霉素、0.1 kg/L鏈霉素以及2mmol/L谷氨酰胺的RPMI 1640培養(yǎng)基, 37℃、體積分?jǐn)?shù) 5%CO2條件下培養(yǎng)。用淋巴細(xì)胞分離液通過密度梯度離心(2 000 r/min 20 min)分離PBL,重懸于RPMI 1640培養(yǎng)基,調(diào)整細(xì)胞濃度為3×105mL-1,加入終濃度為10 mg/L的PHA,置細(xì)胞培養(yǎng)箱中,37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下培養(yǎng);對(duì)照組不加PHA。

1.3 細(xì)胞處理 取對(duì)數(shù)生長期的Molt-4與Jurkat (3×105mL-1)和加入PHA刺激的PBL(3×105m L-1),分別加入50μg/L TNF-α,培養(yǎng)6、12、18、24與36 h收獲細(xì)胞。

1.4 細(xì)胞凋亡及細(xì)胞凋亡周期特異性檢測 常規(guī)膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)/碘化丙啶(PI)法檢測細(xì)胞凋亡:細(xì)胞離心去除培養(yǎng)基,以預(yù)冷(4℃)的結(jié)合緩沖液洗滌細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為 1×106mL-1,取100μL細(xì)胞加入Annexin V-FITC 5μL和PI 10μL,室溫避光反應(yīng)15min后流式細(xì)胞儀檢測,CellQuest軟件(BD公司)獲取并分析數(shù)據(jù)。

API法檢測細(xì)胞凋亡周期特異性[3]:收獲細(xì)胞加入5μL Annexin V-FITC后,室溫避光反應(yīng)30 min,以預(yù)冷的結(jié)合緩沖液洗滌1次,加入1m L不含甲醇的體積分?jǐn)?shù)1%的甲醛,冰上固定30min后,結(jié)合緩沖液洗滌2次,加入0.5mL PI染液[50mg/L PI,500mg/L洋地黃皂甙,10 mmol1,4-哌嗪二乙磺酸(PIPES),2 mmol CaCl2,0.1 mol NaCl],1 h后流式細(xì)胞儀檢測。

細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)/DNA雙參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期特異性的始動(dòng)位點(diǎn):培養(yǎng)細(xì)胞收獲后,用體積分?jǐn)?shù) 80%冷乙醇固定,置于-20℃冰箱過夜,固定后的細(xì)胞用 PBS洗滌 2次,然后用體積分?jǐn)?shù)0.25%TritonX-100在冰上處理5m in,以PBS洗滌2次,然后加入用體積分?jǐn)?shù)1%BSA稀釋的鼠抗人Cyclin E抗體(美國BD公司)0.25μg,4℃孵育過夜。次日細(xì)胞用PBS洗滌后,加入標(biāo)有FITC的羊抗鼠IgG抗體(Sigma公司)(用體積分?jǐn)?shù)1% BSA以體積比 1∶40的比例稀釋),在室溫下孵育30min。再次洗滌細(xì)胞后,用10 mg/L PI和1 g/L RNase A(Sigma公司)在室溫下進(jìn)行DNA染色20 min,采用流式細(xì)胞術(shù)分析。

2 結(jié)果

2.1 Annexin V/PI法檢測細(xì)胞凋亡 對(duì)數(shù)生長期的Molt-4、Jurkat和加入PHA刺激的PBL加入TNF-α后,分別在 18、24和 24 h出現(xiàn)了較為明顯的細(xì)胞凋亡。以早期細(xì)胞凋亡為主,凋亡率為 8%～18%。圖1以Molt-4細(xì)胞為例說明。

2.2 API方法檢測細(xì)胞凋亡的周期特異性 TNF-α誘導(dǎo)的Molt-4、Jurkat和PHA刺激的PBL的細(xì)胞凋亡發(fā)生在G1期,維持周期特異性細(xì)胞凋亡的時(shí)間點(diǎn)分別為18、24和24 h。TNF-α誘導(dǎo)時(shí)間過短凋亡不明顯,時(shí)間過長出現(xiàn)了其他細(xì)胞周期的凋亡細(xì)胞。圖2以Molt-4細(xì)胞為例說明。

2.3 Cyclin/DNA雙參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢測周期特異性細(xì)胞凋亡的始動(dòng)位點(diǎn) TNF-α誘導(dǎo)的Molt-4、Jurkat和PHA刺激的PBL的周期特異性細(xì)胞凋亡的始動(dòng)位點(diǎn)在細(xì)胞周期的G1早期。圖3以PBL為例說明。

3 討論

流式細(xì)胞術(shù)作為分子生物學(xué)的重要技術(shù)與方法,已成為研究細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的重要手段。在過去的研究中,人們探索出了多種檢測細(xì)胞凋亡的方法。如傳統(tǒng)的Annexin V/PI法,但這種方法只能顯示細(xì)胞凋亡率,不能直觀而準(zhǔn)確地顯示細(xì)胞凋亡的周期特異性。該實(shí)驗(yàn)通過API法將細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期的檢測緊密地聯(lián)系在一起。這種方法使用的是非同步化的培養(yǎng)細(xì)胞,細(xì)胞總是處于細(xì)胞周期中。有研究[4]表明細(xì)胞周期可以更為詳盡地分為 6期(G0期、G1早期、G1晚期、S期、G2期以及M期),而API方法只能按傳統(tǒng)的細(xì)胞周期三分法進(jìn)行細(xì)胞凋亡的周期特異性定位,不能更精確地顯示周期特異性凋亡的始動(dòng)位點(diǎn)。Cyclin/DNA雙參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)很好地解決了這一難題。Cyclins是一類呈細(xì)胞周期特異性表達(dá)﹑累積與分解的蛋白質(zhì),通過時(shí)相性激活細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶驅(qū)動(dòng)細(xì)胞周期的進(jìn)行[5-6]。Cyclins的表達(dá)具有時(shí)相性[7]。Cyclin/ DNA雙參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)將單個(gè)細(xì)胞中Cyclin E的表達(dá)情況和細(xì)胞在細(xì)胞周期中所處的位置結(jié)合起來,對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行較為詳盡的區(qū)分。Cyclin E在G1早期合成,在細(xì)胞進(jìn)入 S期時(shí)達(dá)到最高,并于細(xì)胞通過S期時(shí)逐漸被降解[8-9]。在Cyclin/DNA雙參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)的二維等高圖中,G0期細(xì)胞不表達(dá)Cyclin E,G1早期細(xì)胞Cyclin E為弱陽性而G1晚期細(xì)胞為強(qiáng)陽性,將 G1期分為G1早期和G1晚期,同時(shí)將G0期與G1期分開。根據(jù)人類Cyclin E的表達(dá)模式圖[4],該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示膜受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡Cyclin E的表達(dá)降低,細(xì)胞被阻滯在G1早期而走向凋亡。

綜上所述,Cyclin/DNA雙參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)可以精確而直觀地反映受體途徑的細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期的關(guān)系,從而為針對(duì)性地研究G1早期的細(xì)胞周期調(diào)控事件在凋亡過程中的作用提供良好的平臺(tái);為膜受體途徑的細(xì)胞凋亡在腫瘤形成、生物治療、自身免疫性疾病和神經(jīng)系統(tǒng)退化性疾病發(fā)生中的作用提供理論指導(dǎo)。這一方法的實(shí)施中需要注意:不同細(xì)胞的周期特異性凋亡的最佳時(shí)間點(diǎn)不同,這可能與細(xì)胞膜的受體表達(dá)量有關(guān),作用時(shí)間過長,過多的細(xì)胞碎片和代謝產(chǎn)物影響培養(yǎng)環(huán)境,如出現(xiàn)旁觀者效應(yīng)而影響結(jié)果的分析[10];可通過Annexin V/PI法選擇最佳的凋亡時(shí)間點(diǎn)獲得最穩(wěn)定的凋亡模型,從而顯示出典型的周期特異性。

[1]Borgne A,Golsteya RM.The role of cyclin-dependent kinases in apoptosis[J].Prog Cell Cycle Res,2003,5:453

[2]Gong J,LiX,Darzykiewic Z.Different patterns of apoptosis of HL-60 cells induced by cyclohexim ideand camptothecin [J].JCell Physiol,1993,157(2):263

[3]Tao D,Wu J,Feng Y,etal.Newmethod for the analysis of cell cycle-specific apoptosis[J].Cytometry,2004,57(2):70

[4]覃吉超,陶德定,舒丹,等.一種新的細(xì)胞周期分析方法[J].癌癥,2001,20(2):206

[5]Hartwell LH,Weinert TA.Checkpoints:controls that ensure the order in cell cycle events[J].Science,1989,246(A 930):629

[6]Nurse P.Universal controlmechanism regulating onset of M-phase[J].Nature,1990,344(6 266):503

[7]Gong J,Traganos F,Darzynkiewicz Z.Staurosporine blocks cellprogression through G1between the cyclin D and cyclin E restriction points[J].Cancer Res,1994,54(12):3 136

[8]Du lic V,Lees E,Reed SI.Association of human cyclin E with a periodic G 1-S phase protein kinase[J].Science, 1992,257(5 078):1 958

[9]Koff A,Giordano A,Desai D,et al.Formation and activation of a cyclinE-cdk2 complex during the G1 phase of human cell cycle[J].Science,1992,257(5 077):1 689

[10]Mitchell SA,Randers-pehrson G,Brenner DJ,et al.The bystander response in C3H 10T 1/2 cells:the in fluence of cell-to-cell contact[J].Radiat Res,2004,161(4):397