曲古菌素A對(duì)食管癌細(xì)胞系EC1細(xì)胞凋亡的影響*

馬俊芬,李 沛,黃幼田,楊洪艷,鄭智敏,董子明

鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室鄭州 450001

#通訊作者,男,1953年生,博士,教授,研究方向:腫瘤發(fā)病機(jī)制及生物治療,E-mail:dongzm@zzu.edu.cn

曲古菌素A(trichostatin A,TSA)是一種組蛋白去乙?；?histonedeacetylase,HDAC)抑制劑,能抑制組蛋白去乙酰化酶的活性。它能夠通過改變組蛋白的乙?；癄顟B(tài),從而選擇性地調(diào)控腫瘤相關(guān)基因,已成為一種新的腫瘤治療制劑[1-2]。TSA對(duì)腫瘤的抑制作用可以表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面:細(xì)胞周期的阻滯,誘導(dǎo)凋亡及抑制血管增生。為了解 TSA對(duì)食管癌EC1細(xì)胞凋亡的影響,作者進(jìn)行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料 RPMI 1640(美國Gibco公司),胎牛血清(天津TBD生物有限公司),TSA(美國Sigma公司),Annexin V-FITC試劑盒(江蘇碧云天生物公司),Bax鼠抗人單抗及Bcl-2兔抗人單抗(美國Santa Cruz公司),食管癌EC1細(xì)胞(香港大學(xué)曹世華教授惠贈(zèng))。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) EC1細(xì)胞在含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期,然后分為 4組,實(shí)驗(yàn) 1、2及 3組分別用含 0.3、0.5和1.0μmol/L TSA培養(yǎng),對(duì)照組用0.44 g/L的DMSO培養(yǎng)。

1.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞 分組作用 24 h后,收集細(xì)胞上清,用 0.5 g/L胰蛋白酶消化細(xì)胞,細(xì)胞懸液與上清液合并,離心,制備單細(xì)胞懸液,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。取至少 106個(gè)細(xì)胞移入新的 1.5 mL EP管中,190μL冰預(yù)冷 1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,加10μL Annexin V-FITC輕輕混勻,室溫避光放置10min,1 000 r/min離心5min,棄上清,加入195μL 1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,加入5μL PI,室溫避光孵育10m in。另設(shè)未染色管、單染Annexin V-FITC管及單染PI管;以未染色管調(diào)零機(jī)器,以Annexin VFITC單染管和PI單染管作為基準(zhǔn)參照,測(cè)定每個(gè)上樣管數(shù)據(jù),利用CellQuest 3.0軟件進(jìn)行參數(shù)獲取和資料分析,計(jì)算凋亡細(xì)胞百分比。

1.4 Western Blot檢測(cè)Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)分組作用 24 h后,按照細(xì)胞總蛋白試劑盒說明提取總蛋白,Bradford法檢測(cè)蛋白質(zhì)的含量,50μg上樣量,用120 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行垂直電泳分離,轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,用50 g/L牛血清白蛋白封閉3 h,分別加入Bax和Bcl-2一抗,4℃過夜。將膜放于TBST稀釋的二抗中,室溫輕搖2 h,用TBST洗滌3次,使用HRP-ECL發(fā)光法顯影,結(jié)果用Gel-Doc圖像分析軟件進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 10.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。4組細(xì)胞凋亡率和Bax、Bcl-2表達(dá)的比較行單因素方差分析,組間多重比較采用Bonferroni法,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 4組細(xì)胞凋亡率測(cè)定結(jié)果 與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)1組細(xì)胞的凋亡率無明顯變化,隨著TSA濃度升高,實(shí)驗(yàn) 2、3組細(xì)胞凋亡率呈增加趨勢(shì),見表 1。

2.2 4組細(xì)胞Bax、Bcl-2表達(dá)的變化 與對(duì)照組相比,0.3μmol/L TSA處理后EC1細(xì)胞促凋亡蛋白Bax和抑制凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)無明顯變化,0.5μmol/ L TSA處理后EC1細(xì)胞Bax的表達(dá)增加,而Bcl-2的表達(dá)減少,1.0μmol/L TSA處理后EC1細(xì)胞Bax的表達(dá)增加和Bcl-2表達(dá)減少更明顯。見圖1,表1。

圖1 4組細(xì)胞Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)

表1 4組細(xì)胞凋亡率(n=5)及Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)(n=3)的比較

3 討論

TSA源自鏈霉菌代謝產(chǎn)物,是一種強(qiáng)效HDAC抑制劑。HDAC抑制劑通過活化凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。與細(xì)胞凋亡相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要包括死亡受體和線粒體凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在死亡受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中Fas、FasL及TRAIL是主要蛋白,Insinga等[3]研究表明HDAC抑制劑丙戊酸可以通過選擇性上調(diào)白血病細(xì)胞中Fas、FasL及TRAIL的表達(dá),從而活化死亡受體凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡。HDAC抑制劑還可以調(diào)控Bcl-2家族蛋白的表達(dá)和亞細(xì)胞定位,活化線粒體凋亡信號(hào)通路而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族蛋白是一類調(diào)控細(xì)胞凋亡的蛋白,主要分為兩大類:一類包括Bax、Bid、Bcl-xs等含BH3結(jié)構(gòu)域的促凋亡蛋白,這些蛋白形成同源二聚體,嵌在線粒體膜上,通過增強(qiáng)線粒體膜通透性,促進(jìn)細(xì)胞色素c(Cytc)和凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis inducing factor,AIF)的釋放,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;另一類是抗凋亡蛋白,包括Bcl-xL和Bcl-2,這些蛋白過表達(dá)后與Bcl-2家族中的促凋亡蛋白結(jié)合形成異源二聚體,從而阻斷Cytc和AIF的釋放,抑制細(xì)胞凋亡[4]。

作者分別用0.3、0.5、1.0μmol/L TSA培養(yǎng)細(xì)胞24 h,用Annexin V-FITC和PI雙染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)EC1細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,0.3μmol/L TSA處理24 h后細(xì)胞凋亡率沒有明顯變化,0.5μmol/L TSA處理后EC1細(xì)胞凋亡率增加;隨著TSA作用濃度的增加,Bax的表達(dá)量增加,而Bcl-2則減少。表明TSA可以引起促凋亡基因蛋白Bax表達(dá)上調(diào)和抑制凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào),從而引起EC1細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能為:一方面TSA可以在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)Bax和下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)水平,使線粒體膜的通透性增強(qiáng)而活化線粒體凋亡信號(hào)通路[5-7];另一方面TSA通過調(diào)控Bcl-2家族蛋白的亞細(xì)胞定位誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,這種作用和細(xì)胞質(zhì)中DNA末端識(shí)別和結(jié)合蛋白Ku70蛋白密不可分,Ku70可與Bax結(jié)合,抑制Bax向線粒體膜的轉(zhuǎn)運(yùn)。TSA促進(jìn)Ku70的乙酰化水平,使其釋放與之結(jié)合的Bax[8]。Bax轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體膜上,形成同源二聚體,增強(qiáng)線粒體膜的通透性,引起Cytc的釋放,誘導(dǎo)EC1細(xì)胞的凋亡。Bax既可以自身形成同源二聚體,又可以與 Bcl-2結(jié)合成異源二聚體并定位于質(zhì)膜上,Bcl-2與Bax的結(jié)合是Bcl-2發(fā)揮作用的前提。當(dāng) Bax在細(xì)胞內(nèi)過量表達(dá),形成同源二聚體增多,破壞了Bcl-2與Bax的結(jié)合。與Bax分離的Bcl-2失去抗凋亡能力,使細(xì)胞對(duì)死亡信號(hào)的反應(yīng)增強(qiáng)。

總之,TSA作用EC1細(xì)胞后可以通過調(diào)控Bcl-2家族蛋白的表達(dá)和亞細(xì)胞定位兩個(gè)方面,活化線粒體凋亡信號(hào)通路,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9],但是否還與其他基因的表達(dá)改變有關(guān)尚有待進(jìn)一步研究。

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