γ射線輻照對淋巴細(xì)胞殺傷效果的探討

溫 濤,張淑琴,趙 君

(河南省紅十字血液中心 河南鄭州 450012)

輸血相關(guān)性移植物抗宿主病(transfusion associated graft-versus-host disease,TA-GVHD)是一種致命性輸血并發(fā)癥,其發(fā)病率為0.01%～0.1%,病死率高達(dá)80%～90%[1]。該病起病突然,不易診斷,進(jìn)展迅速,療效較差,因此重在預(yù)防。目前普遍認(rèn)為 γ射線輻照血是預(yù)防TA-GVHD的唯一途徑[2]。但國內(nèi)對輻照血尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn),筆者對 γ射線輻照對懸浮紅細(xì)胞中淋巴細(xì)胞的影響進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器:血液輻照儀,德國STS公司產(chǎn),其放射源為137Cs,γ射線強(qiáng)度為0.662 MeV,活度為117 TBq,中心劑量為2.93Gr/min,劑量分布的均勻度為±8%。無菌接口機(jī),日本泰爾茂公司產(chǎn)。KUBITA 2100離心機(jī),日本KUBITA公司產(chǎn)。Sartorius BP-2105電子天平,德國產(chǎn)。3100TR液體閃爍計數(shù)儀,美國產(chǎn)。CO2培養(yǎng)箱,美國產(chǎn)。

1.1.2 試劑:三聯(lián)采血袋,血液保養(yǎng)液為ACD-B,懸浮液為MAP,購自山東威高公司;淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基RP-MI-1640,上海博升公司產(chǎn);PHA,sigma公司產(chǎn);小牛血清,哈爾濱獸醫(yī)研究所;Hank's液,天津灝洋公司產(chǎn)。3H-TdR工作液(取3H-TdR原液,3.7×107Bq/ml 1份加39份培養(yǎng)液稀釋成3H-TdR工作液,濃度為9.25 ×107Bq/ml),脂溶性閃爍液 (取1,4-雙5-苯基惡唑基-2-苯0.5 g,加少量二甲苯,置50-60℃水浴加熱溶解后,再加 2,5-二苯基惡唑 5 g,二甲苯補(bǔ)足至 1000 m l。)聚蔗糖(Ficon)-泛影葡胺(HyPaque)分層液(用純化水將60%泛影葡胺配成34%的溶液,用純化水將聚蔗糖配成9%的溶液,將10份34%的泛影葡胺和24份9%聚蔗糖混合,將比重調(diào)為 1.077±0.001,用高壓蒸汽滅菌器滅菌15 min,無菌分裝后保存4℃冰箱備用。)

1.2.3 標(biāo)本來源及制備:本中心提供全血 30袋,每袋均400m l,制備懸浮紅細(xì)胞:將全血平衡后置入大型低溫離心機(jī)離心,離心力3840 g,時間 12 min,溫度 4 ±2℃,使紅細(xì)胞下沉,讓血漿流入轉(zhuǎn)移袋內(nèi),加入紅細(xì)胞添加劑(MAP),即為紅細(xì)胞懸液。采用無菌接口機(jī)將每袋懸浮紅細(xì)胞分為 2份,分別作為對照組和照射組,對照組每份約100m l,照射組約300ml。將照射組再分為3組,即15Gy組、25 Gy組、35 Gy組。

1.2 實驗方法

1.2.1 輻照:啟動血液輻照儀,取出樣品杯,將需要輻照的血液產(chǎn)品放入樣品杯中,使血袋管子朝下放置,切勿使血袋任何部分露出容器外。將裝有血袋的樣品杯放入輻照艙,使杯低的鎖針正確的鎖定與轉(zhuǎn)盤上,關(guān)閉艙門。設(shè)置輻照劑量(分別設(shè)置15 Gy、25 Gy、35 Gy),啟動按鍵“START”,血液進(jìn)入輻照狀態(tài)。輻照結(jié)束后,停機(jī)后打開艙門,取出容器內(nèi)的血液,關(guān)閉艙門,關(guān)機(jī)。

1.2.2 檢測:用無菌接口機(jī)取樣進(jìn)行檢測,從對照組和15Gy組、25 Gy組、35 Gy組留取懸浮紅細(xì)胞10 m l,加等量的 Hank's溶液,均勻。加分層液于試管中,其量約5 ml,用吸管沿管壁緩緩將血液加入分層液面上。離心,2000 r/min,25 min后,單個核細(xì)胞懸浮于血漿與分層液的界面,呈白膜狀。

1.2.3 操作:對照組和各照射組分別用尖吸管吸取界面的白膜層,置于另一試管中,分別用淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基(RPMI1640)適量稀釋后,用淋巴細(xì)胞分離液離心分離淋巴細(xì)胞,RPMI1640洗 2遍,將淋巴細(xì)胞重懸于RPMI1640中。用Ficon-HyPaque分層液分離淋巴細(xì)胞,用含15%小牛血清的RPMI1640將細(xì)胞懸浮成2 ×106/m l。

1.2.4 淋巴細(xì)胞活性的測定:于96孔U型培養(yǎng)板進(jìn)行有絲分裂原 PHA刺激實驗,每孔加淋巴細(xì)胞 100 μl、PHA 100μl,對照孔加15%的小牛血清Hank's液100μl,于37℃5%CO2培養(yǎng)4 d后,加3H-TdR20μl繼續(xù)培養(yǎng) 18 h。培養(yǎng)結(jié)束后,收集細(xì)胞于玻璃纖維濾紙上,并用水沖洗,烘干后分別浸入閃爍液瓶中,液閃儀測定3H摻入量。

1.2.5 反應(yīng)抑止率的計算方法:輻照對淋巴細(xì)胞免疫增殖功能的殺傷效果,用各輻照組與對照組的3H摻入量對比所得的淋巴細(xì)胞反應(yīng)抑止率來表示。反應(yīng)抑止率的計算如下:

2 結(jié)果

血液經(jīng)不同劑量輻照后的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)抑制率,見表 1～3。

表1 15 Gy照射對淋巴細(xì)胞的殺傷效果

表2 25 Gy照射對淋巴細(xì)胞的殺傷效果

表3 35Gy照射對淋巴細(xì)胞的殺傷效果

3 討論

TA-GVHD是指免疫缺損或免疫抑制的患者不能清除輸入血液中具有免疫活性的淋巴細(xì)胞,使其在體內(nèi)植活、增殖,將患者的組織器官識別為非己物質(zhì),作為靶目標(biāo)進(jìn)行攻擊、破壞的一種致命的輸血并發(fā)癥[1]。γ射線輻照血液被認(rèn)為是預(yù)防TA-GVHD的主要手段,國內(nèi)血站已開始提供輻照血[3],它是利用放射性同位素137Cs衰變中產(chǎn)生的 γ射線,穿透有核細(xì)胞,直接使細(xì)胞核DNA產(chǎn)生不可逆的損傷并干預(yù)其正常的修復(fù)過程,造成淋巴細(xì)胞喪失有絲分裂的活性核停止增殖,從而大大降低同種免疫和TA-GVHD。最佳的輻照劑量,應(yīng)是既能完全殺傷淋巴細(xì)胞的增殖能力,又能最大限度的保持其他細(xì)胞的正常功能為原則。目前,國內(nèi)外對輻照劑量的選擇存在爭議,AABB推薦的輻照最低劑量標(biāo)準(zhǔn)為25 Gy,日本紅十字會建議的最低劑量為15 Gy,而國內(nèi)黎儒青等[4]報道用 25 Gy,李志強(qiáng)[5]報道用 30 Gy,吳燕飛[6]、李寶華[7]報道用 35 Gy,直接取得體內(nèi)試驗結(jié)果也存在困難,因此,主要來自體外試驗結(jié)果?；诿绹獛靺f(xié)會(AABB)制定的最低γ射線輻照劑量為25 Gy,本試驗選擇15 Gy、25 Gy、35 Gy的137Csγ射線輻照,輻照后淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)抑制率分別為(82.4±4.5)%、(96.3±1.4)%、(98.7±1.1)%。通常認(rèn)為,γ射線輻照應(yīng)使淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)抑制率＞95%,才能有效預(yù)防TA-GVHD的發(fā)生。本試驗表明25Gy輻照后淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)抑制率＞95%,說明把25 Gy作為最低輻照劑量,可起到預(yù)防TA-GVHD發(fā)生的效果,是一個比較適合的輻照劑量。

[1] Agbaht K,Altintas ND,TopeliA,et al.Transfusion-associated graftversus-host disease in immunocompetent patients:case series and review of the literature[J].Transfusion,2007,47(8):1405-1411.

[2] 李曉娣,黃象娟.血液輻照應(yīng)用及對血液質(zhì)量影響的研究進(jìn)展[J],臨床血液學(xué)雜志(輸血與檢驗版),2008,21(4):322-323.

[3] 邢培清,張淑琴,溫濤,等.137Cs射線輻照對懸浮紅細(xì)胞質(zhì)量的影響研究[J].河南醫(yī)學(xué)研究,2009,18(2):97-102.

[4] 黎儒青,蔣天倫,肖瑞卿,等.不同劑量γ射線對紅細(xì)胞中細(xì)胞因子含量的影響[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2006,28(24):9542-9743. [5] 李志強(qiáng),樂嘉宜,瞿益華,等.60Coγ射線照射與去白細(xì)胞血漿部分細(xì)胞因子含量變化的研究[J].中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜志, 2006,26(4):943-946.

[6] 吳燕飛,余晉林,聶凱聲,等.袋血輻照對淋巴細(xì)胞凋亡及紅細(xì)胞活性的影響[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2006,26(12):1789-1793.

[7] 李寶華,李冬,江新泉,等.袋血輻照對紅細(xì)胞活性影響[J].泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2007,28(9):386-388.