硒化殼聚糖促進體外培養(yǎng)皮膚成纖維細胞增殖

鄧守恒 楊敬寧 曹鳳軍 蔡曉軍 鄧守平 陳萍

殼聚糖 [β(1,4)-2-氨基-2-去氧-D-葡萄糖]是一種來源于海洋生物的堿性生物多糖,具有抗腫瘤、抗炎、抗菌等多種生物活性,且生物相容性良好,幾乎無毒性及其他不良反應,在現(xiàn)代藥物制備中經(jīng)常作為良好的藥物材料進行開發(fā)[1]。硒是人和動物體內(nèi)必需的微量元素之一,亦具有廣泛的抗氧化,抗腫瘤,抗炎等活性,硒化殼聚糖[2]是將殼聚糖與亞硒酸在酸性條件下,以混合金屬離子為催化劑,通過拼合原理制備的有機硒,具有硒和多糖的雙重功效。本實驗觀察了硒化殼聚糖對體外培養(yǎng)的人皮膚成纖維細胞增殖的影響,并分析了可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 硒化殼聚糖由福建醫(yī)科大學藥化系合成,含硒量為 0.4%;DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)及小牛、胎牛血清購自 Gibco公司;乳酸脫氫酶(LDH)、四甲偶氮唑藍(MTT)購自 Sigma公司;3H-脫氧胸腺嘧啶核苷酸(3H-TdR)購自北京中國原子能研究所。

1.2 實驗儀器 多孔細胞樣品收集器(上海分析儀器總廠);倒置顯微鏡(日本 Olympus公司);BeckmanLX20全自動生化測定儀(美國 Beckman Coulter公司);Medal680酶標儀(美國 Bio-Rad公司);LS3801型液閃計數(shù)儀(美國 Beckman Coulter公司)。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)：將術(shù)中取下的包皮在無菌條件下漂洗,剪成1mm×1mm×1mm組織塊,培養(yǎng)于含 15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,置 37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每 3天換 1次液,待長成致密單層后,用濃度為 2.5 g/L的胰酶消化,按體積比為 6傳代,第 6代細胞用于實驗[3],用細胞培養(yǎng)液配制硒化殼聚糖,根據(jù)硒化殼聚糖濃度不同分為空白對照組、25、50、100、200、400mg/L共 6組。

1.3.2 倒置顯微鏡觀察：取第 6代細胞,5×108個/L接種于24孔板,每孔接種 0.5ml,CO2箱培養(yǎng) 24 h后分為試驗組和對照組繼續(xù)培養(yǎng) 48h,于倒置顯微鏡下觀察,照相。

1.3.3 MTT法檢測硒化殼聚糖對細胞增殖活性的影響 取第6代細胞,5×103個/ml接種于 96孔板,每孔接種 100μl,CO2箱培養(yǎng) 48 h,按分組加入不同濃度的硒化殼聚糖繼續(xù)培養(yǎng)24 h,換培養(yǎng)液為 DMEM(100μl/孔),加入濃度為 5 g/L的MTT(25μl/孔)繼續(xù)培養(yǎng) 4h后加入二甲基亞砜(100μl/孔),于波長 540 nm處測各光密度值。

1.3.4 硒化殼聚糖對細胞生長動力學的影響：取第 6代細胞,5×103個/m l接種于 96孔板,每孔接種 100μl,CO2箱培養(yǎng)24 h貼壁后按分組加入不同濃度硒化殼聚糖繼續(xù)培養(yǎng),每天消化加藥孔和對照孔各 3孔細胞計數(shù),計算均值,隔天給未計數(shù)的細胞換液并加藥,以培養(yǎng)時間為橫軸,細胞數(shù)為縱軸繪制生長曲線,倍增時間的計算公式[4]：細胞倍增時間 =培養(yǎng)時間(d)×log2/(log起始細胞數(shù) -log培養(yǎng)后細胞數(shù))。

1.3.5 3H-TdR摻入法測定 DNA合成[5]：取第 6代細胞,5×103個/m l接種于 96孔板,每孔接種 100μl,CO2箱培養(yǎng)48h,按分組加入不同濃度的硒化殼聚糖繼續(xù)培養(yǎng) 24 h后加入3H-TdR 37MBq/L,繼續(xù)培養(yǎng) 24 h后用 0.25%胰酶消化并轉(zhuǎn)移至玻璃纖維濾紙上,依次用 0.9%氯化鈉溶液、10%三氯醋酸、無水乙醇沖洗固定干燥后加閃爍液,液閃計數(shù)儀測定每分鐘閃爍次數(shù)值(counts perminute,cpm)。

1.3.6 LDH漏出率的測定[6]：取第 6代細胞,5×103個/ml接種于 96孔板,每孔接種 100μl,CO2箱培養(yǎng) 48 h,按分組加入不同濃度的硒化殼聚糖繼續(xù)培養(yǎng)24 h,用全自動生化分析儀檢測上清液中 LDH的含量,將培養(yǎng)板中的細胞用 0.25%胰酶消化,收集細胞,超聲波粉碎后加入 PBS液,用全自動生化分析儀檢測 LDH的含量,LDH漏出率的計算公式：漏出率 =(LDH上清液-LDH胞內(nèi))/LDH胞內(nèi)。

1.4 統(tǒng)計學分析 應用 SPSS 12.0統(tǒng)計軟件,計量資料以±s表示,采用 t檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 倒置顯微鏡觀察結(jié)果 6組細胞均呈放射狀排列,排列規(guī)則整齊,胞體較大,生長良好,各藥物濃度組與空白對照組相比,外觀形態(tài)未發(fā)生明顯改變。見圖 1。

2.2 MTT法及3H-TdR摻入法檢測硒化殼聚糖對成纖維細胞增殖影響 硒化殼聚糖能促進成纖維細胞增殖,25mg/L及以上濃度硒化殼聚糖即可使成纖維細胞數(shù)量增加,對 540 nm波長光線吸收增多,促進成纖維細胞對 3H-TdR的摻入。50mg/L硒化殼聚糖組吸光度值大于空白對照組(P＜0.05)。400mg/L硒化殼聚糖組 cpm值大于空白對照組(P＜0.01)。見表 1、圖 1。

表1 硒化殼聚糖對體外培養(yǎng)成纖維細胞增殖的影響±s

表1 硒化殼聚糖對體外培養(yǎng)成纖維細胞增殖的影響±s

注： 與空白對照組比較,＊P＜0.05,#P＜0.01

組別 吸光度值(A) cpm值空白對照組 0.481±0.02 1 0564±356 25 mg/L硒化殼聚糖組 0.513±0.02 1 4872±390＊50 mg/L硒化殼聚糖組 0.558±0.01＊ 1 5281±365＊100mg/L硒化殼聚糖組 0.602±0.01＊ 1 5821±487＊200mg/L硒化殼聚糖組 0.627±0.01＊ 1 6734±397＊400mg/L硒化殼聚糖組 0.633±0.02＊ 1 8658±356#

2.3 硒化殼聚糖對成纖維細胞生長動力學及 LDH漏出率影響 從生長曲線來看各濃度硒化殼聚糖組成纖維細胞增殖均比空白對照組明顯增快,先于空白對照組細胞數(shù)量達到飽合密度而進入停滯期,隨后細胞出現(xiàn)退化死亡。根據(jù)公式計算可知,400mg/L硒化殼聚糖組的群體倍增時間與空白對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01),其他各濃度組細胞群體倍增時間均比空白對照組有所縮短。硒化殼聚糖可降低皮膚成纖維細胞 LDH漏出率,隨著藥物劑量的加大漏出率降低越來越明顯,呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系,當劑量 ＞100mg/L時,對 LDH漏出率的影響與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表 2、圖 1。

圖 1 硒化殼聚糖對皮膚成纖維細胞生長曲線的影響

表 2 硒化殼聚糖對皮膚成纖維細胞倍增時間和 LDH漏出率的影響±s

表 2 硒化殼聚糖對皮膚成纖維細胞倍增時間和 LDH漏出率的影響±s

注：與空白對照組比較,＊P＜0.05,#P＜0.01

組別 倍增時間(d) LDH漏出率(U/ml)空白對照組 3.54±0.01 25.11±1.26 25 mg/L硒化殼聚糖組 3.19±0.01 23.76±1.14 50 mg/L硒化殼聚糖組 3.05±0.01＊ 23.21±1.76 100mg/L硒化殼聚糖組 2.84±0.01＊ 17.61±1.29＊200mg/L硒化殼聚糖組 2.80±0.01# 16.23±1.17#400mg/L硒化殼聚糖組 2.74±0.01# 15.98±0.89#

3 討論

MTT是一種黃色的水溶性染料,活細胞線粒體內(nèi)膜上具有有活性的琥珀酸脫氫酶,該酶可使黃色的 MTT還原為藍紫色的甲臢顆粒,活細胞數(shù)量越多,細胞內(nèi)甲臢顆粒越多,其對540nm波長光線吸收也越多,我們可通過測定細胞在540 nm波長處吸光度值來了解活細胞數(shù)量多少,吸光度值越大,活細胞數(shù)目就越多,細胞增殖也就越旺盛。本實驗中,筆者采用 MTT法檢測了硒化殼聚糖對成纖維細胞增殖的作用并研究了其對細胞動力學的影響,結(jié)果顯示硒化殼聚糖能明顯促進成纖維細胞增殖,25mg/L硒化殼聚糖作用成纖維細胞 24 h,即可使細胞增殖加快,數(shù)量增加,濃度越高,效果越明顯。細胞生長曲線圖也顯示,各濃度硒化殼聚糖均可促進成纖維細胞增殖,比空白對照組先進入平臺期,成纖維細胞經(jīng)各濃度硒化殼聚糖處理后,細胞群體倍增時間均比空白對照組有所縮短。

脫氧胸腺嘧啶核苷酸是合成DNA的原料之一,細胞分裂增殖旺盛則 DNA合成加快,細胞對脫氧胸腺嘧啶核苷酸的需求量增加。本研究采用 3H-TdR摻入量測定發(fā)現(xiàn)硒化殼聚糖可增強成纖維細胞對 3H-TdR摻入量,促進成纖維細胞DNA復制合成,與MTT檢測結(jié)果一致。LDH是存在于細胞漿內(nèi)參與糖酵解反應的酶,進行離體細胞培養(yǎng)時,如果培養(yǎng)的細胞受損,LDH會由細胞漏出至培養(yǎng)液中,通過測定培養(yǎng)液中 LDH可衡量細胞受損的程度,如果加入藥物干預,可用于藥物安全性的考察[7]。本實驗通過測定成纖維細胞培養(yǎng)液中LDH和細胞內(nèi)LDH相對量來評價硒化殼聚糖對成纖維細胞損害情況,結(jié)果顯示硒化殼聚糖并沒有增加LDH的漏出率,反而能降低 LDH漏出率,對細胞起一定的保護作用,同時光鏡下觀察成纖維細胞形態(tài)上未出現(xiàn)明顯受損改變,顯示其不良反應較小,其藥用價值值得進一步研究。

1 Zarzycki R,Modrzjewska Z.Use of chitosan in medicine and biomedical engineering.Polim Med,2003,33：47-58.

2 孫蘭萍,張勝義,許暉.硒化殼聚糖的制備及理化性質(zhì)的研究.食品工業(yè)科技,2006,27：145-151.

3 黎鰲,楊宗誠主編.實驗燒傷外科學.第 1版.重慶：重慶大學出版社,1997.268-269.

4 Tomas P.Vickery Trinkaus-Randall.Regulation ofbasic fibroblastgrowth factor binding and activity by cell density and heparan sulfate.The Journal of Biological Chemistry,1999,274：534-540.

5 Shin VY,Liu ES,Koo MW,et al.Cigarette smoke extracts delay wound healing in thestomach：involvementofpolyam ine synthesis.Exp Biol Med(Maywood),2002,227：114-124.

6 洪慶濤,宋岳濤.細胞培養(yǎng)液乳酸脫氫酶漏出率的比色測定及其應用.細胞生物學雜志,2004,226：74-79.

7 Lobner D.Comparison of the LDH and MTT assays for quantifying cell death：validity for neuronal apoptosis.Journal of Neuroscience Methods,2000,96：147-152.