HIV/AIDS實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)進(jìn)展

魏明 田臨紅 程義新

HIV/AIDS實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)進(jìn)展

魏明 田臨紅 程義新

獲得性免疫缺乏綜合征;臨床實(shí)驗(yàn)室技術(shù);進(jìn)展

獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome)簡(jiǎn)稱艾滋病(AIDS),是由人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,H IV)感染所引起的一種嚴(yán)重的傳染性疾病。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)一直是診斷 HIV/AIDS的主要依據(jù)。自1985年第一代 HIV抗體問世以來,HIV病原學(xué)檢測(cè)方法有了長(zhǎng)足的進(jìn)步。各種檢測(cè) HIV的新技術(shù)層出不窮,實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法也在不斷提高和更新。本文就近年來 HIV/AIDS實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的研究進(jìn)展綜述如下。

1 HIV的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

H IV呈球形或卵形,直徑 90～130nm,包膜由病毒特有的蛋白質(zhì)附著于一薄層類脂質(zhì)構(gòu)成。其核心含有兩條相同拷貝的 RNA鏈,其外周是由多種蛋白質(zhì)形成的核膜。HIV同其他逆轉(zhuǎn)錄病毒一樣,基因組中存在三個(gè)大的開放讀框,其順序是gagpolenv.Gag基因編碼 55 kD的前體蛋白,在病毒成熟過程中,被 pol基因編碼的蛋白酶加工,分別產(chǎn)生核心蛋白 P17,核殼蛋白 P24和核酸結(jié)合蛋白 P15。P24是核殼組成蛋白,構(gòu)成病毒的核衣殼,它的結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定,是 HIV-1型的特異性蛋白。在 H IV-2與 P24對(duì)應(yīng)的是主要核心抗原 P32,為 HIV-2型病毒感染的特異標(biāo)志。Env編碼包膜蛋白,由外膜糖蛋白 gp120和跨膜糖蛋白 gp41組成 (在 HIV-2型病毒中與之相當(dāng)?shù)氖莋p110/130和 gp36)[1]。CD4是 HIV最重要的靶細(xì)胞,在 CD4淋巴細(xì)胞內(nèi)反轉(zhuǎn)錄酶將 RNA逆轉(zhuǎn)錄成前病毒DNA,接著整合到宿主細(xì)胞基因組 DNA中,而后和細(xì)胞一起復(fù)制。

2 HIV抗體檢測(cè)

迄今為止,血清學(xué)實(shí)驗(yàn)依然是 HIV實(shí)驗(yàn)室診斷的主要依據(jù)[2]。血清學(xué)實(shí)驗(yàn)即H IV抗體檢測(cè),是 HIV感染診斷的常規(guī)方法,分為初篩實(shí)驗(yàn)和確認(rèn)實(shí)驗(yàn)兩個(gè)步驟。

2.1 初篩實(shí)驗(yàn) 包括酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)、快速檢測(cè)(RT)實(shí)驗(yàn)、尿液 HIV抗體檢測(cè)等。常用的初篩實(shí)驗(yàn)是酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA),ELISA試劑在經(jīng)過了第 1代、第 2代、第3代后,已經(jīng)發(fā)展到第 4代檢測(cè)試劑[3]。1985年,美國(guó) FDA批準(zhǔn)使用第 1代ELISA檢測(cè)試劑,第1代試劑主要以病毒裂解物或部分純化的病毒抗原包被反應(yīng)板,以檢測(cè)血清中的抗體。由于包被的抗原不很純,假陽性率較高,結(jié)果不令人滿意。1990年,第 2代試劑應(yīng)運(yùn)而生,第 2代試劑使用了基因工程的重組或人工合成多肽 HIV抗原包被反應(yīng)板,抗原組成一般包括P24、gp 36、gp41、gp120,能同時(shí)檢測(cè) HIV-1,HIV-2型,其特異性較第 1代試劑有了很大的提高。1992年美國(guó)研究出第 3代試劑,使用雙抗原夾心法檢測(cè)抗體,進(jìn)一步提高了敏感性;另外,由于第 3代試劑能同時(shí)檢出 IgM抗體,因此可以縮短窗口期,但仍存在漏檢的問題。第 4代試劑,則在第 3代的基礎(chǔ)上進(jìn)一步增加了 P24抗原的檢測(cè),把H IV抗原和抗 P24的抗體同時(shí)包被反應(yīng)板,同時(shí)檢測(cè)血清中的 HIV抗體和 P24抗原,進(jìn)一步縮短“窗口期”。與第 3代試劑相比,第 4代試劑檢測(cè)窗口期平均縮短 4～5 d。

2.2 確認(rèn)試驗(yàn) 包括免疫印跡試驗(yàn)(WB)、條帶免疫試驗(yàn)(LIATEK H IVⅢ)、放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)及免疫熒光試驗(yàn)(IFA)。國(guó)內(nèi)常用的確認(rèn)試驗(yàn)方法是 WB,其中最早出現(xiàn)的條帶是 P24或 gp 160。WB有直接使用病毒裂解物作為抗原的,也有使用重組抗原和合成肽的。HIV特異性抗體檢測(cè) EIA(高敏感性),加上 WB(高特異性),診斷的準(zhǔn)確率 ＞99%,假陽性率約為 0.0006%,造成錯(cuò)誤診斷的機(jī)會(huì)幾乎是“0”[4]。

3 P24抗原檢測(cè)

機(jī)體感染 HIV后,P24抗原是較早能從血清中檢出的病原學(xué)標(biāo)志,感染后 2～3周即可檢出,1～2個(gè)月左右進(jìn)入抗原高峰,然后隨著抗體的產(chǎn)生形成抗原抗體復(fù)合物,由于抗體的中和作用,P24抗原濃度下降至難以測(cè)出的水平。進(jìn)入無癥狀期,HIV抗體持續(xù)陽性。從機(jī)體感染 HV到產(chǎn)生相應(yīng)抗體的這段時(shí)間叫窗口期,一般 1～9個(gè)月,平均 2～3個(gè)月,但 95%以上HIV-1感染者產(chǎn)生抗體的時(shí)間是在感染后 6個(gè)月以內(nèi)[5]?？乖谘蹇贵w陽轉(zhuǎn)前 2～18 d即可檢測(cè)到,H IVP24抗原檢測(cè)主要是作為 HIV抗體檢測(cè)窗口期的輔助診斷。通常采用夾心法EIA,即將純化的已知抗體包被在固相反應(yīng)板孔底,當(dāng)加入待測(cè)血清后,若血清中含有 P24抗原則與包被抗體形成抗原-抗體復(fù)合物。再加入酶(HRP)標(biāo)記的HIV抗體,在抗原上又結(jié)合了酶標(biāo)記的抗體,加底物顯色后,在酶標(biāo)儀上讀結(jié)果。近年來為了提高檢測(cè)血清中 P24抗原的敏感性,將血清中免疫復(fù)合物解離(ICD)后再進(jìn)行測(cè)定,發(fā)展了 ICDP24抗原測(cè)定試劑,用于H IVP24抗原測(cè)定。

4 HIV核酸檢測(cè)

H IV核酸檢測(cè)有定性和定量 2類,前者用于HIV感染的輔助診斷,后者常用于監(jiān)測(cè)HIV感染者的病程進(jìn)展和抗病毒治療效果。HIV核酸定性檢測(cè)通常使用 PCR或逆轉(zhuǎn)錄 PCR(RTPCR)技術(shù),使用分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室通用的基因擴(kuò)增試劑,引物可來自文獻(xiàn)或自行設(shè)計(jì),應(yīng)盡量涵蓋所有的或常見的毒株,也可使用復(fù)合引物。H IV RNA定量測(cè)定(病毒載量測(cè)定)方法有逆轉(zhuǎn)錄 PCR試驗(yàn)(RT-PCR)、核酸序列擴(kuò)增試驗(yàn)(NASBA)、分枝 DNA雜交試驗(yàn)(bDNA)和熒光實(shí)時(shí) PCR技術(shù)等。

最近,熒光實(shí)時(shí)定量 PCR(FQ-PCR)檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用使PCR的發(fā)展進(jìn)入到一個(gè)新境界。傳統(tǒng)的 PCR是擴(kuò)增后進(jìn)行終點(diǎn)(end point)檢測(cè),而熒光實(shí)時(shí) PCR則可以進(jìn)行實(shí)時(shí)(real time)檢測(cè),改變了傳統(tǒng)的電泳終點(diǎn)檢測(cè),可以進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控,得到相應(yīng)的 S型擴(kuò)增曲線。不但可以進(jìn)行定性檢測(cè),更重要是可以進(jìn)行定量檢測(cè),樣品中待測(cè)DNA/RNA拷貝數(shù)越高,則 S型擴(kuò)增曲線出現(xiàn)越早,若有已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品,則可以得到未知樣品的拷貝數(shù)。美國(guó) PE公司于 1996年發(fā)明 Taqman技術(shù),已廣泛應(yīng)用于基因檢測(cè)。熒光實(shí)時(shí) PCR檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用,使得血漿病毒載量的測(cè)定方法在原來的 RT-PCR、分支DNA技術(shù)(bDNA)、核酸序列擴(kuò)增系統(tǒng)(NASPA)基礎(chǔ)上,又增加了一種新的方法。該方法可以檢測(cè)血漿病毒載量,也可以檢測(cè)血液中單個(gè)核細(xì)胞的前病毒載量。一般來說,前病毒載量與血漿病毒載量是平行的,具有相關(guān)性[6]。但是,經(jīng)過高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(HAART)治療后,血漿病毒載量可能檢測(cè)不到,前病毒載量依然可以檢測(cè)到。前病毒載量,也應(yīng)該成為一個(gè)評(píng)價(jià) HAART的指標(biāo)。

5 CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞檢測(cè)

計(jì)數(shù)CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量,是以細(xì)胞內(nèi)P24抗原作為標(biāo)志,運(yùn)用流式細(xì)胞儀對(duì) P24抗原陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。在T淋巴細(xì)胞分類中,CD4+代表T輔助細(xì)胞,CD8+代表抑制細(xì)胞和 T殺傷細(xì)胞。HIV感染人體后的主要靶細(xì)胞是CD4淋巴細(xì)胞(也累及其他細(xì)胞)。隨著病情的演變,HIV復(fù)制加快,尤其在AIDS臨床階段,其在淋巴結(jié)中每天復(fù)制可達(dá) 100億左右,且大量釋放到血循環(huán)中,使更多的免疫細(xì)胞與其他細(xì)胞被感染,引起每天破壞的細(xì)胞數(shù)以百萬統(tǒng)計(jì)。大量細(xì)胞的破壞,使CD4淋巴細(xì)胞數(shù)急劇下降,使免疫系統(tǒng)嚴(yán)重被破壞。一般認(rèn)為在疾病早期 CD4淋巴細(xì)胞 ＞0.5×109/L,中期為(0.2～0.5)×109/L,晚期則為(0.05～0.2)×109/L,而臨終期可 ＜0.05×109/L。盡管CD4淋巴細(xì)胞數(shù)不一定能和病毒載量相吻合,但確實(shí)是估計(jì)病情、預(yù)后,以及開始治療的指征之一。在測(cè)定CD4淋巴細(xì)胞時(shí),一般同時(shí)測(cè)定CD8淋巴細(xì)胞,一方面可以了解 CD8淋巴細(xì)胞的變化情況,另一方面兩者的比值也是很重要的疾病嚴(yán)重程度的指標(biāo)。CD4/CD8比例通常為 2∶1,但變化很大(1∶1～3∶1)。若比值 ＜1則意味著免疫狀況不佳,比值越低,則細(xì)胞免疫缺陷越重。

6 HIV細(xì)胞培養(yǎng)

常規(guī)方法是將患者淋巴細(xì)胞與正常人的淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng),適當(dāng)周期培養(yǎng)后測(cè)定培養(yǎng)液H IVP24抗原/RT,進(jìn)而判斷患者的淋巴細(xì)胞是否受到 HIV感染。細(xì)胞培養(yǎng)與血清學(xué)方法相比,專一性很強(qiáng),不會(huì)出現(xiàn)假陽性。但其敏感性不如血清學(xué)或PCR,因?yàn)楸仨氂幸欢〝?shù)量的感染細(xì)胞存在才能培養(yǎng)出病毒來。培養(yǎng)初期,隨著活化細(xì)胞(CD25細(xì)胞)的迅速增加,此時(shí)被H IV感染的活化T細(xì)胞也迅速增殖并復(fù)制出大量病毒;培養(yǎng)末期,隨著細(xì)胞抗病毒能力的增強(qiáng)(包括細(xì)胞的殺傷作用和對(duì)抗H IV感染能力的增強(qiáng))和感染細(xì)胞的衰減,血清中病毒載量逐漸降低,可根據(jù)這一特點(diǎn)進(jìn)行培養(yǎng)和增殖毒種。細(xì)胞培養(yǎng)方法的最大好處是能得到最原始的臨床毒種,其重要意義在于確認(rèn)對(duì)WB不確定的疑感染者及母嬰傳播、嬰幼兒HIV感染者。毒株可供藥物篩選,耐藥性及其生物學(xué)特性等研究。用定量細(xì)胞培養(yǎng)法可測(cè)定細(xì)胞的半數(shù)感染單位(TCID50)和半數(shù)抑制藥物濃度(IC50),用于抗病毒藥物測(cè)定。

體外大量擴(kuò)增基礎(chǔ) CD 4/CD 8比值較高的HIV感染者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)也是可行的,擴(kuò)增的細(xì)胞具備較強(qiáng)的Th1細(xì)胞免疫反應(yīng)能力,在培養(yǎng)晚期具有較弱的 HIV復(fù)制能力,這將為艾滋病的免疫細(xì)胞治療提供必要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),為進(jìn)一步開展臨床實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)[7]。

7 基因芯片技術(shù)的應(yīng)用

基因芯片技術(shù)是近些年發(fā)展起來的新興的生物技術(shù),是指將許多特定的寡核苷酸片段作為探針,有規(guī)律地排列于固相支持物上,然后與待測(cè)的標(biāo)記樣品的基因進(jìn)行雜交,再通過激光共聚焦熒光檢測(cè)系統(tǒng)等對(duì)芯片進(jìn)行掃描,并配以計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一探針上的熒光信號(hào)作出比較和檢測(cè),從而迅速得出所要的信息。目前基因芯片的發(fā)展包括以下幾個(gè)方面：(1)60～70mer Oligo芯片的應(yīng)用推廣：研究發(fā)現(xiàn),70mer左右長(zhǎng)度的單鏈 DNA片段可以最優(yōu)化地反映其所代表的基因[8];(2)SNP(Single Nucleotide Polymorphism)芯片的研制：SNP即單核苷酸多態(tài)性,指基因組中微小的基因序列差異.SNP譜不僅可用于更精確的個(gè)體識(shí)別,而且可用于個(gè)體疾病易感性的檢測(cè)[9];(3)mCGH的應(yīng)用：CGH即比較基因組雜交,雖然是一個(gè)傳統(tǒng)技術(shù),其與 DNA芯片技術(shù)結(jié)合可形成基因芯片-CGH(microarray,CGH,mCGH)技術(shù),由于可高通量地比對(duì)基因組的結(jié)構(gòu)和組成,在腫瘤、新藥研究、藥物敏感性以及新療法的開拓中已開始發(fā)揮著重要的作用[10];(4)基因表達(dá)譜研究：基因表達(dá)譜 (gene expression p ro file)研究可以高通量地檢測(cè)基因表達(dá)信息[11];(5)疾病診斷用基因芯片。

基因芯片技術(shù)以其高通量、快速檢測(cè)的特點(diǎn),在基因表達(dá)、腫瘤診斷、遺傳病診斷、基因分型等諸多領(lǐng)域得以廣泛應(yīng)用。在 HIV檢測(cè)方面,Affymetrix公司開發(fā)出 Gene Chip HIV PRT 440芯片,用于抗H IV逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶藥物的耐藥性分析。對(duì)B亞型的檢測(cè)結(jié)果很好,但對(duì)非B亞型的耐藥性檢測(cè)存在漏檢和錯(cuò)檢。

雖然基因芯片技術(shù)尚需要進(jìn)一步完善,但是可以預(yù)見,在未來的幾年里,其應(yīng)用前景是好的。其不僅可用于HIV的耐藥性檢測(cè)和的基因診斷,甚至可以把許多致病病原體的基因集中在一張芯片上,用一張小小的芯片就可以同時(shí)對(duì)許多微生物的感染進(jìn)行診斷,這不久將成為現(xiàn)實(shí)[2]。

綜上所述,本文從抗體、抗原、病毒、T細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)及基因芯片技術(shù)等綜述了 H IV/AIDS實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)研究進(jìn)展。隨著分子生物技術(shù)的飛速發(fā)展,基因芯片技術(shù)的應(yīng)用,HIV/AIDS的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)正朝著快速、敏感、準(zhǔn)確、自動(dòng)化方向發(fā)展。相信不久的將來,會(huì)有更多的新技術(shù)被應(yīng)用到這一領(lǐng)域。

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1002-7386(2010)07-0860-03

252600 山東省聊城市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科

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