奶牛隱性乳房炎病原菌的分離及藥敏試驗(yàn)*

付新城,龐樹(shù)坤

(1.河北省廊坊市農(nóng)業(yè)局動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所,河北廊坊065000;2.河北省涿州市動(dòng)檢站,河北涿州072750)

奶牛乳房炎[1](Mastitis)是奶牛最普遍的疾病,依其表現(xiàn)形式可分為臨床型乳房炎和隱性乳房炎,臨床型乳房炎主要表現(xiàn)為乳腺腫脹、堅(jiān)硬,乳汁出現(xiàn)凝塊、變色等,從臨床外觀即可確診;隱性乳房炎不表現(xiàn)臨床癥狀,隱蔽性強(qiáng),發(fā)病率高,要用特殊的試驗(yàn)才能檢出乳汁的變化,它不僅使奶產(chǎn)量減少,而且使乳的品質(zhì)大大下降。奶牛乳房炎已成為制約奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的最重要的疾病之一,它不僅影響產(chǎn)奶量,降低牛奶的品質(zhì),還易延長(zhǎng)產(chǎn)后發(fā)情和妊娠時(shí)間,甚至使病牛失去生產(chǎn)性能,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,而且危害人類健康,因而其防治問(wèn)題已日益為人們所關(guān)注。據(jù)報(bào)道,全球約有2.2億頭奶牛,其中1/3的奶?；加懈黝愋腿榉垦?國(guó)內(nèi)關(guān)于乳房炎發(fā)病率的報(bào)道均在46%～70%之間,在丹麥,平均每頭奶牛每年的損失估計(jì)超過(guò)200美元;僅美國(guó)每年因乳房炎造成的損失就達(dá)20億美元,德國(guó)為4.5億馬克;其中70%的損失是來(lái)自隱性乳房炎引起的產(chǎn)奶量下降,中國(guó)每年此項(xiàng)損失為1.35億元人民幣[2-3]。

近年來(lái),各地區(qū)的個(gè)體奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展很快,但由于奶牛隱性乳房炎不易被發(fā)現(xiàn),飼養(yǎng)管理水平差,疾病的防治技術(shù)落后,致使奶牛隱性乳房炎大面積存在;又因亂用和濫用抗生素的現(xiàn)象十分普遍,造成許多病原微生物產(chǎn)生耐藥性,導(dǎo)致隱性乳房炎發(fā)展成嚴(yán)重的臨床型乳房炎,給乳房炎的防治帶來(lái)困難。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選擇某奶牛場(chǎng)臨床健康奶牛50頭進(jìn)行隱性乳房炎檢測(cè)。

1.1.2 乳樣采集 采集乳樣之前消毒4個(gè)乳區(qū),用1 g/L新潔爾滅;消毒乳頭用750 mL/L酒精棉球。棄去前3把奶,每個(gè)乳區(qū)取乳樣10 mL,盛于滅菌離心管中,送試驗(yàn)室檢測(cè)。

1.1.3 儀器 離心管、離心機(jī)、接種環(huán)、載玻片、酒精燈、恒溫培養(yǎng)箱、高壓滅菌鍋、光學(xué)顯微鏡、平皿、試管、電爐、玻璃棒、漏斗、燒杯和錐形瓶等。

1.1.4 培養(yǎng)基、試劑 CMT檢測(cè)試劑(自己配制)。

分離用培養(yǎng)基,綿羊鮮血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯、普通瓊脂培養(yǎng)基。生化培養(yǎng)基及試劑,各種糖發(fā)酵管,三糖鐵瓊脂高層斜面,3%過(guò)氧化氫,65 g/L氯化鈉瓊脂平板,枸櫞酸鈉瓊脂斜面,葡萄糖蛋白胨水,吲哚試劑,甲基紅試劑,16%甲萘酚溶液,醋酸鉛瓊脂,尿素酶高層斜面,半固體瓊脂柱,革蘭染色液,馬尿酸鹽,pH9.6肉湯,40%膽汁,0.1%美蘭牛奶。

1.1.5 藥品 環(huán)丙沙星、氨芐西林、丁胺卡那霉素、氟哌酸、慶大霉素、鏈霉素、青霉素、林可霉素、克林霉素、先鋒霉素V。

1.2 方法

1.2.1 隱性乳房炎的CM T檢測(cè) CMT法:即加利福尼亞乳房炎檢測(cè)法?；驹硎怯靡环N陰離子表面活性物質(zhì)——烷基或烴基硫酸鹽破壞乳中的體細(xì)胞,釋放其中的蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)與試劑結(jié)合沉淀或凝膠。細(xì)胞中聚合的脫氧核糖核酸(DNA)是CMT產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng)的主要成分。乳中體細(xì)胞數(shù)越多,產(chǎn)生的凝膠也就越多,凝結(jié)越緊密。

每個(gè)乳樣取2 mL于測(cè)試盤(pán)中消泡后,加入等量乳房炎指示劑混合后據(jù)混合液的濃度來(lái)判斷牛奶中體細(xì)胞的含量,并據(jù)此檢測(cè)奶牛乳房的健康狀況。判定標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 CM T法判定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for CM T

1.2.2 細(xì)菌分離與培養(yǎng) 選取隱性乳房炎CMT法檢測(cè)為陽(yáng)性得乳樣,將其3 500 r/min離心20 min,取沉淀物,以接種環(huán)劃線的方法接種于鮮血瓊脂平皿、麥康凱瓊脂平皿,置37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h～48 h,觀察菌落生長(zhǎng)情況及形態(tài)特征,挑取典型單個(gè)菌落涂片,革蘭染色,鏡檢。根據(jù)菌落形態(tài)特征、溶血與否、染色特性及菌體形態(tài)初步判定細(xì)菌類屬[4-5],將其分為葡萄球菌、鏈球菌、革蘭陰性桿菌和革蘭陽(yáng)性桿菌等四大類。并進(jìn)一步純化培養(yǎng),最后將純培養(yǎng)物接種于血液瓊脂斜面,低溫冷藏于冰箱供生化試驗(yàn)用。

1.2.3 病原菌的生化鑒定[5-7]根據(jù)菌落形態(tài)特征、革蘭染色特性及鏡檢形態(tài)等將各分離純化的細(xì)菌基本分類并將其分別接種于鮮血瓊脂斜面,37℃培養(yǎng)24 h。按表2方法進(jìn)行生化鑒定。

表2 奶中常見(jiàn)鏈球菌的生化特性[8]Table 2 Biochemical characteristics of Streptococcus in milk

1.2.3.1 葡萄球菌 以標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌為對(duì)照,對(duì)待鑒定的葡萄球菌進(jìn)行兔血漿凝固酶試驗(yàn),據(jù)試驗(yàn)結(jié)果將其分為金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌。

1.2.3.2 鏈球菌 將細(xì)菌純培養(yǎng)物按鏈球菌鑒定程序和表1～表3各項(xiàng)進(jìn)行鑒定。

鏈球菌鑒定程序:

表3 奶牛乳房炎主要革蘭陰性桿菌的生化特性[4,8]Table 3 Biochemical characteristics of Gram-negative bacteria in cow masitis

革蘭陽(yáng)性桿菌:根據(jù)鏡檢有無(wú)芽孢將其分為革蘭陽(yáng)性芽孢桿菌和其他革蘭陽(yáng)性桿菌。

1.2.4 藥物敏感試驗(yàn)

1.2.4.1 藥敏片制備 用打孔器將定性濾紙制成直徑為6 mm的紙片,每50片放入一個(gè)潔凈干燥的青霉素小瓶中,高壓蒸汽滅菌30 min,取出后放入溫箱,干燥備用,各種藥物按常規(guī)方法配制成所需濃度(表4)。用微量移液器向裝有紙片的小瓶中分別加入配制成的各種藥液0.25 mL用無(wú)菌鑷子輕輕翻動(dòng),使濾紙片均勻吸靜藥液,放入4℃冰箱冷藏3小時(shí)取出,將藥敏片平鋪在滅菌平皿中放入37℃溫箱中干燥后,放入滅菌青霉素小瓶中加蓋滅菌橡皮塞,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表4 藥敏片含藥濃度T able 4 The concentration of sensitivity tablet

1.2.4.2 操作方法 選擇從不同乳樣中分離出的典型菌株:金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸埃希菌分別均勻劃線接種于血瓊脂平皿,以紙片法[9]進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)。所選抗菌藥物有:青霉素G、氨芐西林、鏈霉素、慶大霉素、丁胺卡那霉素、先鋒霉素、克林霉素、環(huán)丙沙星、氟哌酸和林可霉素共十種常用抗菌藥?？咕Ч卸?青霉素G和氨芐西林對(duì)葡萄球菌的抑菌直徑≥29mm為敏感,≤28 mm為不敏感;對(duì)鏈球菌抑菌直徑≥28 mm為敏感,≤19 mm為不敏感;其它藥物抑菌直徑≥20 mm為高敏;15 mm～20 mm為中敏;≤15 mm為不敏感。

2 結(jié)果

2.1 CMT法檢測(cè)結(jié)果

CMT法檢測(cè)200個(gè)乳樣中84個(gè)呈現(xiàn)陽(yáng)性,116個(gè)呈現(xiàn)陰性,乳區(qū)陽(yáng)性率為42%,其中強(qiáng)陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性以上的為54個(gè);84個(gè)陽(yáng)性乳樣取自28頭奶牛,頭陽(yáng)性率為56%。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 乳房炎檢測(cè)結(jié)果Table 5 The detection results of mastitis

2.2 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

對(duì)84個(gè)陽(yáng)性乳樣進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)和鑒定,結(jié)果有72個(gè)乳樣檢出13種共98個(gè)菌株。其中葡萄球菌44株,占44.90%;鏈球菌20株,占20.40%,大腸埃希菌11株,占11.22%.詳見(jiàn)表6。由葡萄球菌、鏈球菌、和大腸埃希菌引起的乳房炎占整個(gè)比例的71.43%。而另一個(gè)強(qiáng)陽(yáng)性乳樣則未分離出細(xì)菌,可能為非特異性乳房炎或者是由其他病原微生物引起。

表6 奶牛乳房炎病原菌分離鑒定結(jié)果T able 6 Isolation and identification of bacatria from cowmatitis

表7 病原菌混合感染情況T able 7 Pathogenic bacteria of mixed infection

從表6和表7中結(jié)果可以看出,單純由某一種病原菌引起的乳房炎較少,而多數(shù)是由2種～3種甚至是3種以上的病原菌引起,混合感染的情況比較嚴(yán)重。

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)三批不同乳樣的3種主要病原菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn),結(jié)果表明葡萄球菌對(duì)弗哌酸、環(huán)丙沙星、慶大霉素和丁胺卡那霉素高度敏感,對(duì)林可霉素、克林霉素和先鋒霉素比較敏感,而對(duì)青霉素則基本耐藥;鏈球菌則對(duì)慶大霉素和丁胺卡那霉素敏感性較高;環(huán)丙沙星、林可霉素、慶大霉素和丁胺卡那霉素對(duì)大腸埃希菌較敏感。結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 主要病原菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 8 Drug sensitivity test of main pathogenic bactriamm

3 討論

本試驗(yàn)對(duì)50頭奶牛的乳樣進(jìn)行了檢測(cè),從檢測(cè)的結(jié)果來(lái)看隱性乳房炎的頭陽(yáng)性率為56%,乳區(qū)陽(yáng)性率為58%,這個(gè)結(jié)果與國(guó)際上公布的50%接近,與各地區(qū)比較發(fā)現(xiàn),與楊章平報(bào)道的陽(yáng)性率為54.1%、雙金報(bào)道的61.84%(頭陽(yáng)性率)基本一致,說(shuō)明該地區(qū)牛場(chǎng)隱性乳房炎的發(fā)病率比較低,但患牛乳區(qū)陽(yáng)性率偏高。這說(shuō)明該地區(qū)奶牛場(chǎng)的管理水平和衛(wèi)生條件良好,但仍存在不足。

通過(guò)對(duì)陽(yáng)性乳樣的分離鑒定,共得到13種98個(gè)菌株。其中葡萄球菌的感染率最高,為44.90%,鏈球菌占20.40%,大腸埃希菌桿菌占11.22%。這說(shuō)明該地區(qū)奶牛乳房炎以葡萄球菌為主要病原菌,而且以2種～3種病原菌感染為主,甚至由3種以上病原菌感染,而單純由某一種細(xì)菌感染的情況較少,混合感染相當(dāng)嚴(yán)重,可能這與牛場(chǎng)的消毒管理不嚴(yán)有一定的關(guān)系?；旌细腥臼怯蓛煞N以上的病原微生物同時(shí)參與的感染,其表現(xiàn)嚴(yán)重而復(fù)雜,給奶牛隱性乳房炎的診斷和治療增加了困難。因此我們必須切實(shí)強(qiáng)化衛(wèi)生意識(shí),加強(qiáng)擠奶過(guò)程中的各項(xiàng)衛(wèi)生管理,改善牛舍的的環(huán)境衛(wèi)生,是防治奶牛隱性乳房炎工作的重中之重。

金黃色葡萄球菌和無(wú)乳鏈球菌是傳染性致病菌,其傳播主要發(fā)生在擠奶過(guò)程中,如通過(guò)擦洗乳房用的毛巾、水、擠奶員的手、擠奶杯等傳播,而表皮葡萄球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌、化膿鏈球菌、大腸埃希菌等一些革蘭陰性桿菌屬于環(huán)境性致病菌,其傳播主要通過(guò)牛體、褥草、糞便、泥土等。傳染性致病菌的危害比較大只要感染機(jī)體,就會(huì)形成傳染源,即使感染牛本身不發(fā)病,也會(huì)傳染給其他牛,導(dǎo)致疾病的發(fā)生,因此,對(duì)于這種傳染性病原菌,應(yīng)及早發(fā)現(xiàn)及早之治療,控制傳染源減少感染機(jī)會(huì),尤其應(yīng)注意切斷感染途徑。而環(huán)境性致病菌主要存在于周?chē)h(huán)境中,不可能完全消滅,當(dāng)牛的抵抗力降低時(shí),又可能引起發(fā)病,本試驗(yàn)中在隱性型乳房炎的乳之中分離出的環(huán)境性致病菌所占的比例較大,但并未引起發(fā)病,是因?yàn)樯倭康沫h(huán)境性致病菌侵入機(jī)體,機(jī)體的自身抵抗力強(qiáng)而不發(fā)病,因此經(jīng)常保持牛舍內(nèi)外的干燥清潔,牛體的清潔衛(wèi)生,就可降低環(huán)境性致病菌的感染,減少隱性乳房炎的發(fā)病率。

本試驗(yàn)僅對(duì)常用的藥物作了藥敏試驗(yàn),希望能通過(guò)體外藥敏試驗(yàn)選擇出一種低毒,低殘留的有效藥物。從試驗(yàn)結(jié)果上看,喹諾酮類藥物以殺菌作用強(qiáng)、毒副作用小、經(jīng)濟(jì)實(shí)用等特點(diǎn),是用抗生素治療奶牛乳房炎疾病效果最好的,應(yīng)廣泛使用。

奶牛乳房炎的主要病原菌中絕大部分對(duì)青霉素、鏈霉素耐藥,用傳統(tǒng)的青鏈霉素療法效果已幾乎無(wú)效,但對(duì)慶大霉素、丁胺卡那霉素、氟哌酸和環(huán)丙沙星等敏感性較高,這可能與在治療奶牛乳房炎方面較少使用這些藥物有關(guān)。隨著抗菌藥物[10]的廣泛應(yīng)用和耐藥菌株的增多,細(xì)菌對(duì)常用抗生素的耐藥性越來(lái)越強(qiáng),這不僅給奶牛乳房炎治療的選擇用藥帶來(lái)很大困難,而且這些存在于質(zhì)?；蛉旧w的耐藥基因可以接合的方式在個(gè)菌株、動(dòng)物和人類之間傳播,給人類用藥帶來(lái)很大問(wèn)題。隨著人們對(duì)綠色消費(fèi)需求的提高,建議有關(guān)部門(mén)加強(qiáng)用藥新途徑[11-12],如使用疫苗、純中藥制劑等防治奶牛乳房炎,同時(shí)各養(yǎng)殖戶也應(yīng)加強(qiáng)“預(yù)防為主,防治結(jié)合”的思想意識(shí),加強(qiáng)對(duì)奶牛的飼養(yǎng)管理,不亂用、濫用抗生素,為人類健康減少一份威脅,增添一份安全。

該奶牛場(chǎng)CM T法檢測(cè)表明隱性乳房炎的頭發(fā)病率為56%,乳區(qū)陽(yáng)性率為42%。通過(guò)對(duì)陽(yáng)性乳樣的細(xì)菌分離鑒定,共得到13種98個(gè)菌株。其中葡萄球菌的感染率最高,為44.90%,鏈球菌占20.40%,大腸埃希菌桿菌占11.22%。這說(shuō)明該地區(qū)奶牛隱性乳房炎以葡萄球菌、鏈球菌和大腸埃希菌為主。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明引起該牛場(chǎng)奶牛隱性乳房炎的主要病原菌中絕大部分對(duì)青霉素、鏈霉素耐藥,用傳統(tǒng)的青鏈霉素療法效果已幾乎無(wú)效,但對(duì)慶大霉素、丁胺卡那霉素、氟哌酸和環(huán)丙沙星等敏感性較高。

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