石玉祥,張志勇,支龍彬,李 存,趙淑會,鐘翠紅
(1.河北工程大學(xué),河北邯鄲056038;2.河北省豐潤區(qū)畜牧水產(chǎn)局,河北唐山064004;3.河北定州市畜牧水產(chǎn)局,河北定州037000)
國內(nèi)外的研究表明,雞源性大腸埃希菌的耐藥性復(fù)雜,各地的耐藥性差異大,各地報道的敏感藥物都有所不同;各地不同時間分離的菌株的耐藥也有較大差異,且耐藥性變化快,雞源性腸桿菌的防治效果不僅對養(yǎng)禽業(yè)具有重要意義,而且對人類致病性細(xì)菌的研究也有重要意義[1-2]。本試驗針唐山地區(qū)雞源性腸桿菌耐藥性,利用人工感染大腸埃希菌的雞進(jìn)行藥物篩選試驗,現(xiàn)報道如下。
1.1.1 實驗動物 兔,購于邯鄲市種兔場;小鼠,購于河北醫(yī)科大學(xué)。
1.1.2 培養(yǎng)基配制 高鹽甘露醇培養(yǎng)基按《禽傳染病試驗診斷技術(shù)》配制[3];普通肉湯、斜面培養(yǎng)基、血液瓊脂平板、營養(yǎng)瓊脂、麥康凱、伊紅美藍(lán)、三糖鐵培養(yǎng)基均按其使用說明進(jìn)行配制。
1.1.3 藥敏片 阿莫西林、阿奇霉素、黃連素、頭孢拉啶、利福平藥敏片按《禽傳染病試驗診斷技術(shù)》制備[3]。
1.1.4 大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)抗O血清 購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;腸桿菌科細(xì)菌生化常規(guī)微量發(fā)酵管:購于浙江省軍區(qū)后勤部衛(wèi)生防疫檢驗所。
2.1.1 病料采集 從河北某地區(qū)規(guī)?;B(yǎng)雞場,無菌采取疑是大腸埃希菌病病雞肝臟,置冰箱中凍藏備用。
2.1.2 細(xì)菌培養(yǎng) 首先用肝臟觸片檢查細(xì)菌形態(tài),然后從肝臟釣取細(xì)菌,接種到營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基,置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)24 h,觀察其培養(yǎng)特性;同時挑取所培養(yǎng)圓形凸起、光滑、濕潤、邊緣整齊、半透明、灰白色菌落的細(xì)菌進(jìn)行涂片,經(jīng)革蘭染色法染色,鏡檢,做形態(tài)學(xué)觀察。
2.1.3 細(xì)菌分離、純化培養(yǎng) 將營養(yǎng)瓊脂所培養(yǎng)的上述細(xì)菌接種于高鹽甘露醇、伊紅美藍(lán)、麥康凱培養(yǎng)基中,培養(yǎng)24 h;再挑取選擇培養(yǎng)基上特征性的細(xì)菌菌落進(jìn)行鏡檢,然后分別接種于三糖鐵和營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基中,培養(yǎng)24h;再挑取培養(yǎng)物中的菌落進(jìn)行鏡檢,將不純的細(xì)菌培養(yǎng)物再次進(jìn)行純培養(yǎng),直至得到純培養(yǎng)物。
2.1.4 生化試驗 將大腸埃希菌培養(yǎng)物分別接種至含有葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、靛基質(zhì)、檸檬酸鹽、尿素酶生化常規(guī)微量發(fā)酵管中及糖蛋白胨水溶液后,置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)2 d~3 d,觀察各個發(fā)酵管中有何變化。
按蘭羅勛介紹的方法[4]檢大腸埃希菌測是否有致病性。
按常規(guī)紙片法[5]對致雞肝炎大腸埃希菌和雞舍空氣致病性大腸埃希菌進(jìn)行藥敏試驗,置37℃溫箱中培養(yǎng)24 h后,觀察試驗結(jié)果。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):根據(jù)抑菌圈直徑大小作為判定敏感性的標(biāo)準(zhǔn):15 mm以上判為高度敏感;10 mm~14 mm判為中度敏感;10 mm以下判為低度敏感。然后與同地區(qū)雞舍空氣分離出的大腸埃希菌耐藥程度進(jìn)行比較。
2.4.1 體外抑菌試驗 按傅先強(qiáng)介紹制備藥敏條的方法制作藥敏條和進(jìn)行藥敏試驗及結(jié)果判定[6]。
2.4.2 聯(lián)合用藥對肉雛雞大腸埃希菌病的防治隨機(jī)選擇1日齡健康肉用仔雞400只,按常規(guī)方法飼養(yǎng)管理,常規(guī)疫苗免疫接種。隨機(jī)分為8組,每組50只。其中預(yù)防組1個,治療組3個,對照組4個。
2.4.2.1 預(yù)防試驗 預(yù)防組按常規(guī)飼養(yǎng)7后,配制致病性大腸埃希菌菌液,100 mL水加致病性菌液5 mL(含菌量為108/mL)讓雛雞飲用3 d[7]。3 d后,雛雞按15 mg/L濃度飲新霉素和頭孢拉定(4∶1)組成復(fù)方制劑,連用3 d,觀察21 d,統(tǒng)計死亡數(shù)和保護(hù)率。對照組按常規(guī)方法飼養(yǎng),并用市場銷售的丁胺卡那霉素20 mg/L,連用3 d,觀察21 d,統(tǒng)計死亡數(shù)和保護(hù)率。
2.4.2.2 治療試驗 治療組為常規(guī)飼養(yǎng)至21日齡的雛雞,每只雞肌肉注射大腸埃希菌菌液1 mL(含菌量為108/mL)。于攻毒后同時(oh)、24 h、48 h,雞按30 mg/L濃度飲上述復(fù)方制劑,分上、下午2次給藥,連續(xù)用3 d,觀察10 d,統(tǒng)計死亡數(shù)和保護(hù)率。對照組雞按40 mg/L濃度飲水丁胺卡那霉素,每天上、下午各一次,連用3 d為一個療程,觀察10 d,統(tǒng)計死亡數(shù)和保護(hù)率。
判定標(biāo)準(zhǔn):①痊愈:受試雞用藥3 d后,精神食欲好轉(zhuǎn),糞便恢復(fù)正常,剖檢無明顯的大腸埃希菌病變者為痊愈。②有效:受試雞用藥1個療程后,精神食欲好轉(zhuǎn),糞便有明顯轉(zhuǎn)變,且在試驗期未死亡者為有效。③無效:受試雞用藥一個療程后,癥狀無明顯改善,甚至加重或死亡,死亡剖檢有明顯大腸埃希菌病變特征者為無效[1,8-9]。
將肝組織觸片經(jīng)革蘭染色,鏡檢可見兩端鈍圓、粗短的陰性中等大小桿菌。
按無菌要求將病死雞的病料分別接種于普通瓊脂平板、麥康凱平板和伊紅美藍(lán)平板上,37℃培養(yǎng)24 h后,觀察其結(jié)果。在普通瓊脂平板上長出中等大小、圓形、隆起、光滑、濕潤、半透明帶灰色的菌落;在麥康凱平板上長出邊緣整齊、稍凸起、表面光滑濕潤,直徑1.5 mm~2 mm的粉紅色菌落;在伊紅美藍(lán)平板上長出黑紅色帶有金屬光澤的菌落。將分離的菌落涂片、革蘭染色后,鏡檢可見細(xì)菌形態(tài)與用肝組織直接涂片的相同,均可看見革蘭陰性中等桿菌,以上結(jié)果符合大腸埃希菌的特征。
本株細(xì)菌分離物能發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇;能使葡萄糖、乳糖、麥芽糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣;靛基質(zhì)和甲基紅產(chǎn)酸;硫化氫試驗呈陰性,不能利用枸櫞酸鹽,不分解尿素。細(xì)菌分離物在三糖鐵培養(yǎng)基上斜面生化試驗結(jié)果符合大腸埃希菌的特征。
6 h~15 h內(nèi)發(fā)現(xiàn)試驗組12只小鼠精神萎靡,24小時后試驗組12只小鼠全部死亡,對照組正常.對死亡小鼠解剖觀察發(fā)現(xiàn)心臟出血、淤血,肝、脾出血壞死,腸壁變薄,有出血點(diǎn)。取其病料抹片染色鏡檢及分離培養(yǎng),結(jié)果從病料中均分離到與感染菌生物學(xué)特性相同的細(xì)菌。說明分離到的6株大腸埃希菌均為致病性大腸埃希菌,
藥敏試驗結(jié)果見表2和表3。個別菌株表現(xiàn)出相似的藥物敏感性,對新霉素、丁胺卡那霉素和阿奇霉素高度敏感;對慶大霉素、氟哌酸、頭孢拉定、利福平、阿莫西林中敏或低敏,對羧芐青霉素、黃連素、環(huán)丙沙星、先鋒V具有耐藥性。
聯(lián)合用藥試驗結(jié)果見表4。結(jié)果顯示菌株對兩兩聯(lián)合的效果比單個用藥時敏感的多。效果最好的組合是頭孢拉定與新霉素,頭孢拉定與諾氟沙星和阿莫西林與新霉素組合依次次之,菌株對諾氟沙星與黃連素的組合有耐藥性,則在臨床上應(yīng)采用頭孢拉定與新霉素這兩種抗菌藥物聯(lián)合。
表2 藥敏試驗結(jié)果Table 2 The results of drug sensitive test
表3 多重耐藥菌株占分離菌株比例Table 3 The rate of multi-resistant strains on isolated strains
表4 藥物聯(lián)合試驗T able 4 The tests of Joint administration
3.7.1 臨床預(yù)防試驗結(jié)果 肉仔雞預(yù)防試驗結(jié)果見表5。由表5可知,聯(lián)合用藥預(yù)防肉用仔雞大腸埃希菌病,其發(fā)病率與病死率均較低(觀察10 d),死亡3只(死亡剖檢有明顯大腸埃希菌病變的2只),死亡率為6%。對照組死亡10只(剖檢有明顯大腸埃希菌病變的8只),死亡率20%。二組之間的保護(hù)率具有顯著性差異(P<0.05)。
表5 預(yù)防試驗結(jié)果Table 5 he results of prophylactic trial
3.7.2 臨床治療試驗結(jié)果 由表6可知,肉用仔雞在感染大腸埃希菌的不同時期,用藥治療,其結(jié)果有很大差異,所以對肉雞大腸埃希菌病的治療,應(yīng)早發(fā)現(xiàn)早控制。肉仔雞在攻毒48 h后,用新霉素和頭孢拉丁治療的效果明顯,與對照組相比,二者的保護(hù)率具有顯著性差異(P<0.05)。
表6 臨床治療試驗結(jié)果Table 6 The results of clinical trial
由于大腸埃希菌血清型極多,疫苗免疫效果并不理想,藥物防治仍是主要手段[10]。近幾年,由于長期、廣泛、過量、多品種地使用抗菌藥物和添加劑,加上大腸埃希菌自身又極易產(chǎn)生耐藥性,導(dǎo)致耐藥菌株越來越多,多重耐藥現(xiàn)象也日趨嚴(yán)重。本試驗從唐山地區(qū)分離出18株大腸埃希菌,其中12株有多重耐藥性。所分離的18株大腸埃希菌菌株對多數(shù)氨基糖苷類藥物高度敏感,其中硫酸新霉素敏感率最高為100%;對氟哌酸、頭孢拉定、利福平、阿莫西林中敏或是低敏,敏感率在83.3%~50.0%;對羧芐青霉素、黃連素、環(huán)丙沙星、先鋒V具有嚴(yán)重抗藥性,敏感率均為50.0%~33.3%。由此看來,所分離的大腸埃希菌對青霉素類藥物耐藥性較強(qiáng)。
聯(lián)合用藥防治動物疾病時,不僅減少單種獸藥的劑量,還克服單種獸藥抗菌活性較低的缺點(diǎn),這對大腸埃希菌病的防治和控制藥物殘留而提高動物產(chǎn)品質(zhì)量及避免細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生均有重要意義。本試驗的聯(lián)合用藥試驗和臨床防治結(jié)果表明藥物聯(lián)合應(yīng)用比單一應(yīng)用效果更加明顯。新霉素和頭孢他定拉對大腸埃希菌的抑制作用特別明顯。
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