ERIC-PCR對(duì)山東省東平湖4種常見淡水魚腸道菌群多樣性的分析*

周玉法,劉敬博,苗增民,蔡玉梅*,李代軍

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,山東泰安271018;2.泰安市岱岳區(qū)畜牧局,山東泰安271000)

魚類腸道中寄生著種類繁多、數(shù)量巨大的微生物,它可以幫助消化食物產(chǎn)生一些必需的氨基酸和維生素,對(duì)機(jī)體的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用,并且這些微生物主要是由大量細(xì)菌組成的。微生態(tài)學(xué)研究表明,環(huán)境條件的改變可導(dǎo)致機(jī)體微生態(tài)系統(tǒng)的變化,造成菌群失調(diào),干擾機(jī)體營(yíng)養(yǎng)代謝和免疫功能,甚至嚴(yán)重影響機(jī)體健康,導(dǎo)致一系列疾病的發(fā)生。因此對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)多樣性進(jìn)行研究具有至關(guān)重要的意義。但是,腸道內(nèi)微生物很多都是厭氧菌,用傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)方法很難對(duì)其分析,并且傳統(tǒng)的細(xì)菌分離和培養(yǎng)方法耗時(shí)、費(fèi)力,易受操作方法的影響。而分子生物學(xué)的發(fā)展為分析腸道菌群的結(jié)構(gòu)帶來(lái)了希望。一些分子生物學(xué)研究方法,如質(zhì)粒圖譜、限制性核酸內(nèi)切酶譜、脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)、隨機(jī)引物PCR(RAPD)及ERIC-PCR等,已經(jīng)被應(yīng)用于微生物群落的分析與研究,其中,以ERIC序列為基礎(chǔ)的ERIC-PCR指紋圖譜分析是目前應(yīng)用最廣泛的方法之一,它與其它方法相比,其靈敏度高、可重復(fù)性和可靠性好、且省時(shí)省力[1]。

腸道細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的ERIC序列是一段長(zhǎng)為126 bp的反向重復(fù)序列,定位于基因組內(nèi)可轉(zhuǎn)錄的非編碼區(qū)域或與轉(zhuǎn)錄有關(guān)的區(qū)域,且該序列散布在整個(gè)基因組中,具有極強(qiáng)的保守性,用ERIC-PCR得到的DNA條帶特征能反映細(xì)菌整個(gè)基因組結(jié)構(gòu)的差異,因而能清晰地區(qū)別包含有ERIC重復(fù)序列細(xì)菌的不同種和不同菌株,具有很強(qiáng)的鑒別種乃至菌株的能力[2]。ERIC-PCR技術(shù)已被證明是研究復(fù)合菌群結(jié)構(gòu)的有效手段,并已被廣泛應(yīng)用于各種生物的腸道菌群和環(huán)境復(fù)合菌群結(jié)構(gòu)的研究中[3-6]。但采用ERIC-PCR技術(shù)研究魚類及其他水生生物的腸道菌群研究結(jié)果還未見報(bào)道。

本研究采用ERIC-PCR技術(shù)對(duì)山東省東平湖(山東省第二大淡水湖)常見4種淡水魚(表1)的腸道菌群的組成進(jìn)行了研究,建立了它們的ERICPCR指紋圖譜并分析了它們之間的相似性,從而為本地區(qū)魚類疾病的防治、微生物類添加劑以及微生態(tài)育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用魚

4種健康淡水魚(表1)均采集于東平湖同一水域下的某養(yǎng)殖區(qū)。

表1 山東省東平湖4種常見淡水魚T able 1 four kinds of common fresh water fish from Dongping Lake,Shandong Province

1.2 樣品采集及腸道細(xì)菌總DNA的提取

使用無(wú)菌的牙簽將腸道劃開,剝?nèi)±锩娴哪c道內(nèi)容物。每種魚收集10個(gè)個(gè)體的腸道內(nèi)容物,混合后作為這種魚的代表樣品,置于—20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

用苯酚-氯仿抽提法從魚類腸道樣品中提取基因組DNA,并用100 μ L去離子無(wú)菌水溶解,—20℃冷凍保存?zhèn)溆肹7]。

1.3 ERIC-PCR

采用引物ERIC1(3′-CACT TAGGGGTCCTCGAATGTA-5′)和ERIC2(5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′)[8]進(jìn)行PCR,反應(yīng)體系由以下成分組成:1.5 U Taq DNA聚合酶,引物ERIC1和ERIC2各300 ng/μ L,0.875 mmol/L dNTPs,1×buffer,1.5 mmol/L MgCl2,2 μ L模板DNA,最后用滅菌雙蒸水補(bǔ)充至25 μ L。反應(yīng)參數(shù):95℃5 min;94℃1 min,51℃復(fù)性1 min,72℃延伸3 min,32個(gè)循環(huán);最后72℃延伸16 min,結(jié)束反應(yīng)。進(jìn)行電泳之前,所有PCR反應(yīng)產(chǎn)物在4℃條件下保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)12 g/L～15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳分離,以DL 2 000 Maker作為分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),電泳結(jié)果在紫外分析儀(Tanon-2500,Shanghai,China)上照相。

1.4 ERIC-PCR分析

計(jì)算機(jī)軟件記錄下擴(kuò)增及電泳譜帶,用電泳圖象分析軟件(Gel Image System,Version 4.00)自動(dòng)生成矩陣圖。采用非加權(quán)對(duì)數(shù)算術(shù)平均法(Unweighted pair group method using averages algorithm,UPGMA),利用NTSYS-pc 2.10軟件構(gòu)建聚類樹狀圖。

2 結(jié)果

2.1 ERIC-PCR指紋圖譜的建立

每一條泳道代表1種魚的腸道菌群ERIC-PCR指紋圖譜(圖1)。因?yàn)槊織l泳道代表的是1種魚10個(gè)個(gè)體的混合樣品,所以它反映的是這種魚腸道菌群的平均狀態(tài)。不同位置的條帶代表不同的細(xì)菌,亮度反映出細(xì)菌相對(duì)量的多少。從不同泳道的條帶數(shù)量、位置和亮度的差異表明4種魚的腸道菌群的結(jié)構(gòu)組成是不一樣的,反映了這些魚的腸道細(xì)菌的結(jié)構(gòu)存在明顯的多樣性差異。

圖1 4種魚腸道菌群ERIC-PCR電泳圖Fig.1 ERIC-PCR electrophoresis chart of four kinds of fish

2.2 ERIC-PCR圖譜與腸道細(xì)菌組成分析

用ERIC-PCR方法對(duì)4種魚腸道菌群進(jìn)行擴(kuò)增,得到了每一種魚的腸道菌群聚類樹狀圖,相同種類腸道菌群具有相同的ERIC-PCR指紋圖譜。如圖2所示,樣品1和3的相似性為0.64,說(shuō)明這兩種魚腸道菌群相似性較高,而樣品2和4相似性較差,且與樣品1和3差異也很大,這很可能與這四種魚的食性和生長(zhǎng)的水層有很大關(guān)系。

圖2 4種魚腸道菌群ERIC-PCR聚類分析圖Fig.2 ERIC-PCR analysis chart of microfilaria in four fishes

3 討論

已有多篇研究報(bào)道魚類腸道菌群的組成和食物有著密切的關(guān)系。尹軍霞等[9]用細(xì)菌培養(yǎng)和計(jì)數(shù)的方法對(duì)鰱魚、鳊魚、鯽魚等4種不同食性魚的后腸菌群進(jìn)行了分析后,認(rèn)為后腸內(nèi)容物中的細(xì)菌總數(shù)、后腸內(nèi)容物和后腸壁中的雙歧桿菌數(shù)都與食性相關(guān)。曹志華等[10]用稀釋平板計(jì)數(shù)法對(duì)攝食含尿素飼料和對(duì)照飼料的健康鯉魚腸道菌群進(jìn)行了分析,證明攝食含尿素飼料的實(shí)驗(yàn)組能利用尿素的細(xì)菌占細(xì)菌總數(shù)的比例比對(duì)照組高了30%。周文豪等[11]對(duì)攝食不同餌料的草魚腸道菌群進(jìn)行研究,證明餌料中的菌群在攝食后48 h內(nèi)可以影響草魚腸道菌群的數(shù)量及組成。由于培養(yǎng)的方法具有較高的選擇性,所以大部分采用培養(yǎng)方法的研究報(bào)道主要集中于某幾類細(xì)菌的數(shù)量變化上。

采用分子生物學(xué)技術(shù)比較某種魚類或其他水生生物在2種或3種狀態(tài)下(比如不同養(yǎng)殖場(chǎng)或不同飼料)的腸道菌群差別的研究也被報(bào)道。如Holben等人研究了養(yǎng)殖型和野生型鮭魚的腸道菌群;Huber W E等[12]研究了不同漁場(chǎng)的虹鱒的腸道菌群;Tanaka R J等[13]研究了不同食物條件下的鮑魚腸道菌群[14]。但是,采用ERIC-PCR方法快速分析多種魚類腸道菌群的差異以及觀察這種差異和食性的關(guān)系,還未見報(bào)道。本試驗(yàn)通過(guò)ERIC-PCR分析技術(shù)對(duì)山東東平湖4種常見淡水魚腸道菌群的多樣性進(jìn)行分析,并通過(guò)UPGMA分析了不同食性和腸道菌群多樣性的相關(guān)關(guān)系。

本研究所采用的樣品全部是來(lái)自東平湖同一水域條件下健康成年魚,并且每種魚采用10個(gè)個(gè)體的混合樣品,這樣降低了食性以外的其他因素包括個(gè)體差異對(duì)研究結(jié)果的影響。雖然在東平湖同一水域條件下,很多影響因素不能得到控制,比如水體表層和底層的環(huán)境是不同的,但是對(duì)這4種魚類樣品的研究能夠反映出在同一水域條件下魚類腸道菌群的狀態(tài)。

本研究建立了山東東平湖4種常見淡水魚類在同一水域條件下腸道菌群的ERIC-PCR指紋圖譜,觀察到它們的腸道菌群在同一條件下具有較大差異,并且食性差異大的魚類之間腸道菌群差異也更為明顯。本研究證明,ERIC-PCR技術(shù)是一種能夠快速有效地研究魚類腸道菌群的技術(shù),是較其它方法更簡(jiǎn)單、靈敏度更高、可重復(fù)性和可靠性較好,且能較為全面反映菌群結(jié)構(gòu)多樣性的方法。如果有必要,對(duì)ERIC-PCR優(yōu)勢(shì)條帶DNA的割膠測(cè)序可以進(jìn)一步確定腸道菌群的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。

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