鴨疫里氏桿菌的分離與16 S rRNA的鑒定

馮金牛,阮二壘,楊麗云,黎丁滔,陳瑞愛,王林川,*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣東廣州510642;2.廣東省大華農(nóng)動物保健品股份有限公司,廣東新興527400)

鴨疫里氏桿菌(Riemerella anatipestifer,RA)病是危害水禽養(yǎng)殖業(yè)(特別是養(yǎng)鴨業(yè))的重要疫病之一[1]。家禽中鴨最易感,其中櫻桃谷鴨、番鴨、麻鴨、麗佳鴨等多個品種的鴨均可發(fā)病[2]。本病呈急性或慢性敗血癥過程,以纖維素心包炎、肝周炎、氣囊炎、腦膜炎為特征,部分病例還出現(xiàn)干酪樣的輸卵管炎、關(guān)節(jié)炎。

1904年,Reiemer首次發(fā)現(xiàn)該病(當(dāng)時稱為“鵝滲出性敗血癥”)以來,世界各地相繼報道了該病的流行。國外報道該菌至少有21個血清型[3],不同血清型之間的幾乎沒有交叉保護(hù)[4]。2003年,程安春等[5]對我國分離并鑒定出的1 842株鴨疫里氏桿菌進(jìn)行了血清學(xué)調(diào)查,結(jié)果有15個血清型,其中有4個新血清型的出現(xiàn),這樣使本來血清型復(fù)雜的RA的鑒定和預(yù)防變得更加困難。在臨床和病理變化上,RA的感染和鴨大腸埃希菌病、鴨沙門菌病很難區(qū)別,一般出現(xiàn)兩種或兩種以上細(xì)菌混合感染,所以在臨床診斷上有很大的困難。RA的血清型眾多,同時還有新的血清型出現(xiàn),國內(nèi)市場還沒有全套商品化的陽性血清;傳統(tǒng)的細(xì)菌分離鑒定也很難達(dá)到鑒定RA的目的。本試驗(yàn)根據(jù)GenBank發(fā)布的RA1-19型16 S rNA的保守基因序列設(shè)計并合成一對引物,建立快速檢測RA的PCR方法,并用該方法對疑似病料進(jìn)行檢測鑒定,為本實(shí)驗(yàn)室對RA進(jìn)行分子流行病學(xué)調(diào)查奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 2009年8月到10月廣東省云浮市和惠州市的肉鴨養(yǎng)殖場暴發(fā)疑似鴨疫里氏桿菌病,送檢我們實(shí)驗(yàn)室6只病死雛鴨,無菌采集肝臟、心臟、腦等12份病料。

1.1.2 主要試劑及儀器 細(xì)菌生化鑒定管為杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品;麥康凱培養(yǎng)基、TSA(T ryptic Soy Agar)和TSB(Tryptic Soy Bronth)為北京陸橋技術(shù)有限公司產(chǎn)品。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒為天根生化科技有限公司產(chǎn)品,ExTaqTMDNA聚合酶、dNTPs(each 10 mmol/L)、Mix均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物 根據(jù)GenBank中發(fā)表的鴨疫里氏桿菌(RA)1-19型16 S rRNA基因序列分別與大腸埃希菌、沙門菌、葡萄球菌、巴氏桿菌的16 S rRNA基因序列比對設(shè)計特異性引物:P1:5′-CTGAACACGGTGTACGAATAAG-3′;P2:5′-TCTTATACGAGTCCCCAAC-3′。擴(kuò)增的片段長度為680 bp,引物由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司合成。

1.2.2 分離培養(yǎng) 將無菌采集的病料分別劃線接種到TSA和麥康凱培養(yǎng)基上,置于37℃恒溫培養(yǎng)24 h,選擇可疑菌落進(jìn)行染色鏡檢。

1.2.3 分離菌的鑒別培養(yǎng)及純化 根據(jù)菌落的形態(tài)特征及染色特性對可疑菌落在TSA和麥康凱培養(yǎng)基進(jìn)一步純化培養(yǎng)24 h[6],直到培養(yǎng)基上培養(yǎng)的為單一菌落,并進(jìn)行染色鏡檢觀察染色特性。

1.2.4 生化試驗(yàn) 取單菌落分別接種于5 mL TSB培養(yǎng)基,37℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24 h,鏡檢無雜菌后分別取10 μ L～20 μ L,參考楊宗維等[7]介紹的方法進(jìn)行生化鑒定,然后根據(jù)生化鑒定管說明書要求的不同時間觀察并記錄結(jié)果。

1.2.5 PCR擴(kuò)增及測序 根據(jù)生化試驗(yàn)結(jié)果,選取6株進(jìn)行PCR擴(kuò)增:①取單菌落接種于5 mL TSB液體培養(yǎng)基,37℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24 h,鏡檢無雜菌后按照革蘭陰性菌提取試劑盒提取細(xì)菌基因組。②目的片段的擴(kuò)增及測序:采用25 μ L體系,10 μ L Mix,2 μ L模板,上下游引物各0.5 μ L,三蒸水12 μ L。反應(yīng)程序?yàn)?4℃30 s;94℃5 min,52℃30 s,72℃1 min,30個循環(huán);72℃延伸10 min。產(chǎn)物電泳后按照膠回收試劑盒說明進(jìn)行膠回收,然后將PCR純化產(chǎn)物送北京華大公司測序。③序列比較,將測序結(jié)果放入GenBank中進(jìn)行相似性檢索,對結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.6 動物回歸試驗(yàn) 用TSA上培養(yǎng)純化的細(xì)菌,并用無菌生理鹽水制備成菌懸液(3.5×109cfu/mL),皮下接種于6只14日齡的健康雛鴨,0.5 mL/只[8],連續(xù)觀察7 d,記錄發(fā)病及死亡情況,并對死鴨進(jìn)行細(xì)菌的分離鑒定。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)及染色特性

分離到的6株RA,在TSA上生長24 h后形成圓形微凸起,濕潤,光滑灰白色1 mm～2 mm大小的菌落,用折光觀察菌落帶有藍(lán)色虹光;在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基不生長。菌體呈桿狀或橢圓狀,大小0.3 μ m～0.5 μ m×0.7 μ m～6.5 μ m,偶見個別長絲狀,長11 μ m～24 μ m。多數(shù)為單個,少數(shù)成雙或短鏈排列。革蘭染色陰性。

2.2 生化鑒定結(jié)果

將分離到的6個菌株純培養(yǎng)物分別接種于如上表的各種生化反應(yīng)管,除了精氨酸雙水解酶全部陽性,氧化酶陽性的有5株細(xì)菌,有3株液化明膠;其他的生化反應(yīng)均為陰性(表1)。

表1 分離株的生化反應(yīng)結(jié)果Table 1 The biochemical reaction results of isolates

2.3 PCR結(jié)果及測序

擴(kuò)增完畢后用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,以DNA Marker DL 2000 plus為分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),可見680 bp左右的特異條帶(圖1)。將所得到的序列與GenBank中已知的RA16 S rRNA序列進(jìn)行比對,同源性達(dá)到99.99%。

2.4 動物回歸試驗(yàn)

攻毒24 h后開始出現(xiàn)早期臨床癥狀,不愿行走,少食,拉黃白色稀糞,眼睛周圍有黏性分泌物;48 h～72 h出現(xiàn)神經(jīng)癥狀。搖頭,扭頸,頭頸震顫。72 h死亡60%,168 h全部死亡。剖解病變主要以心包炎,肝周炎,氣囊炎,腦膜炎為主。心臟體積增大、心包液增多,在心包外膜覆蓋一層灰白色纖維素薄膜;肝臟、脾臟腫大,鈍圓,表面淡白色纖維素薄膜;胸、腹部氣囊混濁,表面有點(diǎn)狀淡黃色纖維素碎塊黏著表面,逐漸鈣化(圖2)。能夠從死亡雛鴨的肝、血液和腦中分離出相同的細(xì)菌。

圖1 PCR檢測結(jié)果Fig.1 Results of PCR detection

圖2 肝臟和心臟的病理變化Fig.2 Pathological lesions in liver and heart

3 討論

通過細(xì)菌的分離培養(yǎng),染色鏡檢,生化反應(yīng),以及動物回歸實(shí)驗(yàn)等傳統(tǒng)細(xì)菌分離鑒定方法和利用16 S rRNA保守序列設(shè)計特異引物PCR擴(kuò)增方法,都可以鑒定分離到是鴨疫里氏桿菌。但是相比之下,傳統(tǒng)的生化鑒定試驗(yàn)繁雜而且準(zhǔn)確性較差。本試驗(yàn)通過生化鑒定確定為RA,隨機(jī)取一株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定,所得到的序列通過在GenBank中比對,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與GenBank上發(fā)布的RA的16 S rRNA的同源性達(dá)到99.99%,李永峰等[9]根據(jù)Matsuki的研究,凡是16 S rRNA序列的同源性大于97%便可認(rèn)為是同一種細(xì)菌。近年來,隨著核酸測序技術(shù)的不斷普及,利用PCR技術(shù)對細(xì)菌保守區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增,然后將所得的序列與GenBank中已知序列比對已成為細(xì)菌的快速鑒定方法,而且通過與已知細(xì)菌16 S rRNA全序列進(jìn)行同源性比較,能夠鑒定到屬級。曲豐發(fā)等[10]設(shè)計了一對鴨疫里氏菌16 S rRNA基因的特異性引物190f和843r,分別以基因組DNA和菌落提取液為模板均能擴(kuò)增出大小為654 bp的特異性片段,基因組DNA的最小檢出量為50 pg,菌落最小檢出量為15 cfu/mL;楊苗等[11]建立了基于鴨疫里氏桿菌16 S rRNA PCR檢測方法,只有RA DNA能擴(kuò)增出844 bp的特異性條帶,其他細(xì)菌的DNA不能擴(kuò)增出任何條帶,PCR對RA DNA最小檢出量為22 pg,最少檢出RA菌液為80 cfu/mL。本試驗(yàn)也是根據(jù)鴨疫里氏桿菌16 S rRNA基因的保守序列設(shè)計特異引物來快速檢測RA。該方法與傳統(tǒng)方法相比,周期短,成本低,準(zhǔn)確性高。覃宗華等[12]利用生物軟件對GenBank收錄的鴨疫里氏菌和大腸埃希菌的16 S rRNA基因序列進(jìn)行分析后,設(shè)計了鴨疫里氏菌和大腸埃希菌的種特異性引物,分別能從各自的16 S rRNA基因中擴(kuò)增出長度為342 bp和718 bp的DNA片段。并據(jù)此建立了一種能快速準(zhǔn)確鑒別診斷鴨疫里氏菌和大腸埃希菌病的雙重PCR方法,進(jìn)一步證明基于細(xì)菌16 S rRNA PCR檢測方法不僅可以應(yīng)用快速檢測,同時也可通過構(gòu)建雙重或多重PCR方法可以用來鑒別診斷。本試驗(yàn)在生化試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,應(yīng)用16 S rRNA同源識別驗(yàn)證,總結(jié)出一套簡化的鴨疫里氏桿菌鑒定方法,為鴨疫里氏桿菌的快速鑒定提供基礎(chǔ)。

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