禽流感病毒致病性的分子基礎(chǔ)研究進(jìn)展*

楊彩然,董淑珍,楊宗澤,倪 靜

(河北科技師范學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北昌黎066600)

禽流感病毒屬正黏病毒科,A型流感病毒屬。A型流感病毒感染范圍廣,常以流行形式出現(xiàn),表現(xiàn)為發(fā)病急劇,蔓延迅速,人和動(dòng)物都能感染,危害極大。流感病毒是分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒,由8個(gè)基因片段組成,分別編碼堿性聚合酶1(basic polymerase 1,PBl)、堿性聚合酶2(basic polymerase 2,PB2)、酸性聚合酶(acidic polymerase,PA)、神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase,NA)、血凝素(hemagglutinin,HA)、基質(zhì)蛋白1(matrix protein 1,M1)、基質(zhì)蛋白2(matrix protein 2,M2)、非結(jié)構(gòu)蛋白1(non-structural protein 1,NSl)、非結(jié)構(gòu)蛋白2(non-structural protein 2,NS2)、核蛋白(nucleoprotein,Np)和PB1-F2蛋白等11個(gè)蛋白。論文就禽流感病毒的致病性研究進(jìn)展,從病毒基因編碼的蛋白方面逐一闡述其致病的分子基礎(chǔ)。

1 血凝素(HA)與禽流感病毒致病性的關(guān)系

流感病毒感染的第一步是病毒吸附于細(xì)胞膜上,然后HA經(jīng)過(guò)蛋白酶切割裂解為HA1和HA2兩個(gè)亞單位,才具有感染性,HA的裂解性由以下兩個(gè)結(jié)構(gòu)特征決定。

1.1 HA裂解位點(diǎn)處的氨基酸序列決定H5和H7亞型禽流感病毒的致病力

HA對(duì)宿主蛋白酶敏感性的主要結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是在HA0上連接HA1和HA2的外部圈處的蛋白酶解位點(diǎn)的成分。Senne D A等比較了H5和H7亞型低致病力禽流感病毒(low pathogenic Avian influenza virus,LPAIV)和高致病力禽流感病毒(highly pathogenic Avian influenza virus,HPAIV)的HA氨基酸序列,發(fā)現(xiàn)二者在HA裂解位點(diǎn)處的氨基酸序列不同,通常LPAIV的HA裂解位點(diǎn)處只有單個(gè)的堿性氨基酸,只能在呼吸道、消化道等少數(shù)細(xì)胞中裂解,因此,造成溫和感染或不表現(xiàn)臨床癥狀,而HPAIV的HA裂解位點(diǎn)處有多個(gè)連續(xù)的堿性氨基酸插入,在無(wú)類胰蛋白酶的情況下就能發(fā)生裂解,可以在宿主的很多不同細(xì)胞中裂解為HA1和HA2,造成感染禽全身系統(tǒng)衰竭,導(dǎo)致死亡。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),HA裂解位點(diǎn)處氨基酸在不斷進(jìn)化,唐應(yīng)華等發(fā)現(xiàn)對(duì)雞均為高致病力,而對(duì)麻鴨具有不同致病力的兩個(gè)毒株A/mallard/Huadong/S/2005(簡(jiǎn)稱S病毒)和A/mallard/Huadong/Y/2003(簡(jiǎn)稱Y病毒)的HA裂解位點(diǎn)處氨基酸不同,前者的HA基因在322位是亮氨酸(L),329位氨基酸缺失;而后者的HA基因在322位是谷氨酰胺(Q),329位是賴氨酸(K)。S病毒對(duì)麻鴨致病力高,Y病毒對(duì)麻鴨無(wú)致病力。通過(guò)反向遺傳操作進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),S病毒和Y病毒HA基因裂解位點(diǎn)區(qū)322位和329位氨基酸殘基突變或缺失均影響病毒對(duì)麻鴨的致病力,HA基因的L322位,329位氨基酸缺失,是S病毒和Y病毒的毒力決定因子[1]。

1.2 HA裂解位點(diǎn)和受體結(jié)合位點(diǎn)附近的糖鏈的變化

HA裂解位點(diǎn)附近的糖鏈可干擾蛋白酶到達(dá)裂解位點(diǎn),當(dāng)罩著的糖鏈丟失后,可提高HA對(duì)蛋白酶的敏感性,去除1997年H5N1高致病力流感病毒154位糖鏈,可增加病毒的毒力。受體結(jié)合位點(diǎn)附近增加糖鏈,可影響病毒的致病力[2]。

1.3 特殊氨基酸的作用

Govorkova E A等[3]研究了2004年分離株禽流感病毒對(duì)雪貂的致病力,發(fā)現(xiàn)盡管所有毒株的HA裂解位點(diǎn)都有多個(gè)堿性氨基酸的插入,但是各毒株的毒力不同,說(shuō)明除裂解位點(diǎn)處的氨基酸外,HA的其它位置氨基酸對(duì)病毒的致病力也有一定影響。Diane J H等[4]用反向基因操作技術(shù),研究H5N1亞型禽流感病毒表面蛋白的致病力,改變高致病力毒株A/Chicken/Hong kong/YU562/01和中等毒力毒株A/Goose/Hong kong/437-10/99及其重組毒株的HA的第97、108、126、138、212、217、338位氨基酸,發(fā)現(xiàn)HA的97,108,126,138位氨基酸的變化,可使高致病力禽流感病毒的致病力下降;而對(duì)中等致病力毒株的HA上述位置的氨基酸替換后,病毒致病力增強(qiáng)。另外,改變高致病力和中等致病力病毒HA的212、217位氨基酸均可使病毒的致病作用增強(qiáng)。進(jìn)一步分析這些氨基酸能顯著影響病毒致病力的原因,發(fā)現(xiàn)126位氨基酸在唾液酸結(jié)合位點(diǎn)附近,而且還接近中和表位。138位氨基酸在抗原位點(diǎn)140 S圈內(nèi),是一個(gè)抗原位點(diǎn)[5]。217位氨基酸接近受體結(jié)合位點(diǎn),此氨基酸的改變可提高受體結(jié)合效率,有利于病毒復(fù)制,提高其致病力[4]。

2 神經(jīng)氨酸酶與禽流感病毒致病性的關(guān)系

對(duì)于高致病性禽流感H5和H7亞型病毒而言,其NA莖部的氨基酸丟失與其毒力呈相關(guān)關(guān)系。Yumiko M等[6]通過(guò)分析1996年到2007年期間分離自多種禽類的H5N1亞型禽流感病毒的NA基因發(fā)現(xiàn),大部分禽流感病毒的NA基因頸部長(zhǎng)度變短,并且擁有短頸NA的病毒對(duì)小鼠的致病力增強(qiáng)。

低致病性禽流感病毒NA莖部的氨基酸的改變與病毒毒力的關(guān)系,表現(xiàn)出與高致病性禽流感病毒相同的特性。Egbert M等[7]通過(guò)對(duì)低致病性禽流感病毒(H5N1,H5N2,H5N3)的研究發(fā)現(xiàn),H5N2,H5N3亞型病毒在雞體內(nèi)復(fù)制能力增強(qiáng),并且引起多器官的組織發(fā)生病理變化,而H5N1亞型病毒則沒有引起上述變化。經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn),H5N2,H5N3亞型病毒在雞體內(nèi)復(fù)制后,其NA莖部缺失20個(gè)氨基酸,H5N1病毒NA莖部則未發(fā)生改變。

3 多聚酶復(fù)合物與禽流感病毒致病性的關(guān)系

3.1 PB2蛋白的627位、701位和714位氨基酸突變,可改變病毒的毒力

研究證明,H5N1亞型流感病毒的PB2蛋白627位用賴氨酸取代谷氨酸后,可增加多聚酶的活性,進(jìn)而提高病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的復(fù)制效率[8-9]。

PB2蛋白的701位氨基酸與病毒毒力有關(guān)。Li Z等[10]用分離于健康鴨的兩株H5N1亞型病毒A/Duck/Guangxi/22/2001(DKGX/22)和A/Duck/Guangxi/35/2001(DKGX/35)對(duì)鼠進(jìn)行致病性試驗(yàn)研究表明,DKGX/22對(duì)小鼠沒有致病力,而DKGX/35對(duì)小鼠表現(xiàn)出高致病力。采用反向遺傳方法進(jìn)一步研究,發(fā)現(xiàn)DKGX/22的PA、PB2、NA和NS基因能致弱DKGX/35病毒,但PB2起決定作用,毒株DKGX/22的PB2的第701位氨基酸對(duì)病毒毒力起重要作用,當(dāng)突變701位氨基酸(天冬酰胺取代天冬氨酸)后,DKGX/22可致死小鼠。PB2的另一個(gè)氨基酸——精氨酸(R714)能提高多聚酶的活性,對(duì)病毒毒力也有一定影響。

3.2 PA和PB1蛋白的氨基酸突變,可改變病毒的毒力

多聚酶中,除了PB2之外,PA和PB1也與病毒毒力有關(guān)[11]。Hulse-Post D J等[12]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)病毒的PA第515位氨基酸由蘇氨酸(T)突變?yōu)楸彼?A)時(shí),使病毒對(duì)鴨的致病力減退,但仍保持對(duì)雪貂和小鼠的高致病力,這表明病毒致病力不僅與氨基酸的改變相關(guān),還與宿主種類有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),從野禽中分離到的低致病力H5N2亞型禽流感病毒A/Aquatic bird/Korea/W81/05(W81)在小鼠體內(nèi)連續(xù)傳代后,病毒對(duì)小鼠具有了高致病力,進(jìn)行反向遺傳研究表明,PA在病毒的致病力方面起重要作用,當(dāng)病毒的PA第97位氨基酸由蘇氨酸變?yōu)楫惲涟彼?I)時(shí),對(duì)小鼠的致病力增強(qiáng)[13]。

另外,通過(guò)PB1的436位酪氨酸(Y)被組氨酸(H)取代后,可使病毒毒力降低。值得注意的是,在自然感染途徑下,PA(T515A)和PB1(Y436H)氨基酸的突變,可減少對(duì)鴨的致病力,而靜脈注射兩者依然能殺死鴨,說(shuō)明病毒致病力還與組織嗜性有關(guān)。

3.3 PB2、PB1和PA多個(gè)氨基酸的變化與病毒致病力有關(guān)

通過(guò)比較1918年的流感毒株和隨后的人流感病毒多聚酶基因和鳥類毒株的多聚酶基因發(fā)現(xiàn),共有10個(gè)氨基酸發(fā)生了改變(PB2 199A1a→Ser、PB2 475Leu→Met、PB2 567Asp→Asn、PB2 627Glu→Lys、PB1 375Asn/T hr→Ser、PA 55Asp→Asn、PA 100Val→Ala、PA 382G1u→Asp、PA 552Thr→Ser)。值得注意的是在目前流行的H5N1亞型毒株中也發(fā)現(xiàn)了其中的一些變異,說(shuō)明這些變異有利于病毒在人類細(xì)胞的復(fù)制,能增強(qiáng)致病力[14]。

4 基質(zhì)蛋白

一些研究表明,流感病毒的M1蛋白的C末端域經(jīng)修飾后方可感染小鼠[15-16]。M1蛋白的N末端和中間結(jié)構(gòu)域的變異與病毒在鼠肺的復(fù)制有關(guān)。Fan S等[17]研究表明,禽流感病毒H5N1亞型的M1蛋白第30位天冬氨酸和215位丙氨酸的累加效應(yīng)是對(duì)小鼠高致病力所必需,M1蛋白第30位天冬氨酸和215位丙氨酸正是處于M1蛋白N末端和C末端。

5 非結(jié)構(gòu)蛋白與禽流感病毒致病性的關(guān)系

5.1 通過(guò)NS基因的替換研究,病毒的毒力發(fā)生改變

Li Z等[18]利用反向基因操作技術(shù)對(duì)從鵝體內(nèi)分離到的對(duì)SPF雞具高致病性H5N1亞型流感病毒A/Goose/Guangdong/1/96(GS/GD/1/96)及另一株對(duì)SPF雞無(wú)致病性的H5N1亞型病毒A/Goose/Guangdong/2/96(GS/GD/2/96)的NS基因片段進(jìn)行單基因替換,測(cè)定救獲的病毒在SPF雞體內(nèi)的靜脈內(nèi)致病指數(shù),發(fā)現(xiàn)病毒的NS基因在病毒的致病性方面起著關(guān)鍵的作用。當(dāng)GS/GD/1/96的NS基因被GS/GD/2/96相應(yīng)基因替換后,救獲的病毒R-GS/GD/1-2NS的靜脈內(nèi)致病指數(shù)由2.1降低到0,反之,當(dāng)GS/GD/2/96的NS基因被GS/GD/1/96相應(yīng)基因替換后,救獲的病毒R-GS/GD/2-1NS的靜脈內(nèi)致病指數(shù)由0升高到1.0。用救獲的病毒R-GS/GD/1/96和R-GS/GD/1-2NS進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn),通過(guò)鼻腔感染4周齡SPF雞后,這兩株病毒表現(xiàn)出完全不同的致病能力,R-GS/GD/1/96病毒在雞體內(nèi)復(fù)制能力很強(qiáng),感染后3 d、6 d,各組織臟器均可發(fā)現(xiàn)大量的病毒抗原,感染雞的各組織臟器均發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的病理?yè)p傷,對(duì)雞的致死率為100%;而R-GS/GD/1-2NS病毒在感染雞體內(nèi)只引起肺間質(zhì)少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),對(duì)雞的致死率為0,進(jìn)一步證實(shí)了NS基因決定H5N1亞型禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1/96對(duì)SPF雞的致病能力。

5.2 NS1蛋白的單個(gè)氨基酸突變、截短和刪除,使病毒毒力發(fā)生變化

Li Z通過(guò)比較兩個(gè)致病性不同的毒株GS/GD/1/96與GS/GD/2/96的NS1基因發(fā)現(xiàn),二者只有149位氨基酸存在差異,并發(fā)現(xiàn)NS1基因的第149位為丙氨酸時(shí)可抑制雞胚成纖維細(xì)胞中Ⅰ型干擾素(interferon,IFN)的產(chǎn)生[19]。

NS1的42位氨基酸是對(duì)病毒的致病作用的又一重要的氨基酸,H5N1亞型禽流感病毒的NS1蛋白第42位脯氨酸(P)被絲基酸(S)代替后,可極大地增加病毒對(duì)小鼠的致病力。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)H5N1亞型禽流感病毒的NS1蛋白的42位絲氨酸是頡頏宿主細(xì)胞產(chǎn)生干擾素的關(guān)鍵因素,其通過(guò)抑制雙鏈RNA介導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子к B(nuclear factor-κ B,NF-к B)反應(yīng)、抑制干擾素調(diào)節(jié)因子3(interferon regulatory factor 3,IRF-3)依賴的啟動(dòng)基因的激活及抑制IFN的前mRNAs 3′末端的加工過(guò)程而發(fā)揮作用。通過(guò)研究還發(fā)現(xiàn),在病毒DK/27的NS1蛋白的38位精氨酸(R)或K41位的兩個(gè)氨基酸中至少有1個(gè)為堿性氨基酸時(shí),NS1對(duì)小鼠有致病性[19],NS1蛋白的R38位和K41位氨基酸位于RNA結(jié)合域,其可抑制IFN的產(chǎn)生而使流感病毒呈現(xiàn)出毒性作用[20]。

William G D等[21]對(duì)1999年到2000年期間流行在意大利北部分離自禽類的40株H7亞型流感病毒(包括22株低致病力病毒和18株高致病力病毒)的NS1基因進(jìn)行序列分析,研究發(fā)現(xiàn),NS1基因有兩個(gè)不同程度的C末端截短,其中16個(gè)毒株的NS1蛋白是由230個(gè)氨基酸構(gòu)成,沒有發(fā)生變化,有6個(gè)毒株的NS1被截短,剩下220個(gè)氨基酸NS1蛋白,其余18個(gè)毒株的NS1蛋白C末端序列的中間被截?cái)?剩下224個(gè)氨基酸。而這18個(gè)毒株均為高致病力毒株。分離自H7N1流行初期的低致病力毒株的NS1蛋白沒有截?cái)喟l(fā)生。分離自H7N1流行后期的低致病力毒株的NS1蛋白則發(fā)生了截?cái)唷?/p>

龍進(jìn)學(xué)等[22]通過(guò)比較41株H5N1亞型AIV的NS序列發(fā)現(xiàn),共有22株均在NS1的263位～277位核苷酸處發(fā)生了缺失,而且此22株均是2000年后的分離株。采用反向遺傳方法,用救獲的重組病毒對(duì)雞進(jìn)行致病性試驗(yàn),結(jié)果表明,NS第263位～277位核苷酸缺失的重組病毒提高了病毒對(duì)雞的致病力。

5.3 NS1蛋白C末端的4個(gè)氨基酸殘基影響病毒毒力

Obenauer J C等[23]對(duì)從野鳥和家禽中分離出的大量H5N1亞型病毒的基因序列進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)多數(shù)H5N1亞型禽流感病毒的NS1蛋白的C末端包含谷氨酸-絲氨酸-谷氨酸-纈氨酸(ESEV)的氨基酸序列,這些殘基能與帶有PDZ位點(diǎn)的蛋白質(zhì)結(jié)合,而含有PDZ位點(diǎn)的許多蛋白質(zhì),在許多關(guān)鍵的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(包括調(diào)節(jié)細(xì)胞膜蛋白的活動(dòng)與運(yùn)輸功能,以及維持細(xì)胞的極性和形態(tài)等)中起重要作用。體外研究表明,H5N1亞型禽流感病毒NS1蛋白的C末端氨基酸序列易與人的PDZ域結(jié)合,中斷含有PDZ的蛋白質(zhì)參與細(xì)胞合成的重要過(guò)程,因而使H5N1亞型禽流感病毒的NS1蛋白呈現(xiàn)一定毒性[24]。

6 核蛋白與禽流感病毒致病性的關(guān)系

流感病毒的NP第184位丙氨酸被賴氨酸取代后,可增加病毒對(duì)雞的致病性。而NP的184位氨基酸恰巧位于幾個(gè)帶正電荷氨基酸組成的RNA結(jié)合袋狀區(qū)域內(nèi),當(dāng)184氨基酸突變?yōu)橘嚢彼釙r(shí),其帶正電荷,能與帶負(fù)電荷的RNA結(jié)合,使病毒更有效地復(fù)制,破壞雞的免疫系統(tǒng),從而增加其致病性[25]。

7 結(jié)語(yǔ)

流感病毒的致病力是多因素相互作用的結(jié)果,其不僅和病毒本身有關(guān),而且宿主因素也很重要。在病毒因素中,病毒的多個(gè)基因共同作用,其中多聚酶基因、NS基因和HA基因起主要作用,但這些基因間及基因與宿主間的關(guān)系很復(fù)雜,有待進(jìn)一步深入研究。

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