雞傳染性法氏囊病病毒秦皇島株的分離鑒定*

魯改儒,張艷英,孟立根

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸醫(yī)學(xué)院,河北定州073000;2.河北師范科技學(xué)院,河北秦皇島066000)

雞傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)于1957年首次在美國特拉華州南部的甘布羅(Gumboro)地區(qū)發(fā)現(xiàn)(又稱甘布羅病)[1]。該病現(xiàn)己呈全球性流行,據(jù)調(diào)查美國雞群的血清陽性率近100%,南美為90%,荷蘭為88%,意大利為76%,日本約為75%,德國為61.50%[2]。目前IBD在我國已傳遍各地,某些地方發(fā)病率高達(dá)80%以上,病死率在30%～70%或以上[3]。IBDV主要侵害4周齡～6周齡的雛雞,破壞雞的體液免疫器官——法氏囊,它主要破壞法氏囊中正在分化成熟的B淋巴細(xì)胞,引起雞的急性發(fā)病甚至死亡,亞臨床感染雞和康復(fù)雞可產(chǎn)生免疫抑制和生長抑制[4-5],增加了對新城疫、馬立克病和傳染性支氣管炎等的敏感性[6]。1987年,一種以高發(fā)病率和高病死率為特征的IBDV超強(qiáng)度(vvIBDV)或高致病力IBDV(hvIBDV)毒株陸續(xù)在荷蘭、英國、比利時、德國、日本等國家報道,辛桂香等報道我國也存在著這種vvIBDV[7]。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為vvIBDV是引起雞IBD免疫失敗的主要因素。近年來由于變異株和超強(qiáng)毒株的不斷出現(xiàn),免疫失敗時有發(fā)生,給IBD的防控帶來了極大的困難[8-10]。IBDV感染火雞、鴨、雛鵝、鴕鳥、灰天鵝、雉雞等的病例也相繼有報道,因此本病己成為危害世界養(yǎng)禽業(yè)最嚴(yán)重的傳染病之一。

近年來,IBD流行出現(xiàn)了一些新的特點:病死率比過去增高,過去一般在10%以下,現(xiàn)在一般為13%～50%,超強(qiáng)毒株病死率高者可達(dá)94%[11];IBD流行多在使用本病弱毒疫苗4 d～7 d后發(fā)病;IBD的流行不僅抑制或降低了雛雞對多種疫苗(尤其是新城疫疫苗)的免疫應(yīng)答,而且提高了雞對某些微生物的易感性[12]。

本病主要是通過發(fā)病情況、臨床癥狀、病理剖檢進(jìn)行臨床診斷,對流免疫電泳和PCR技術(shù)等實驗室方法可鑒定毒株的類型,以指導(dǎo)臨床正確選擇疫苗,進(jìn)行科學(xué)的免疫預(yù)防和有效控制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 秦皇島某養(yǎng)雞場送檢的4周齡蛋雞8只。

1.1.2 試劑 1 000 IU/mL青鏈霉素,雞傳染性法氏囊病標(biāo)準(zhǔn)抗原(效價1∶64)(哈爾濱獸醫(yī)研究所),標(biāo)準(zhǔn)陽性血清(效價1∶128)(哈爾濱獸醫(yī)研究所),PBS緩沖液,巴比妥緩沖液(pH 8.6、離子強(qiáng)度0.05m ol/L),15 g/L瓊脂糖、蛋白酶K(北京欣源佳和生物有限公司),100 g/L十二烷基硫酸鈉(SDS),飽和酚(批號20081214),氯仿∶異戊醇(24∶1),TE緩沖液(pH 8.0),70%乙醇(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司,批號20090215),無水乙醇(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司,批號20081205),RT buffer(反應(yīng)緩沖液),DTT(二硫蘇糖醇,上海前塵生物科技有限公司),dNTP(三磷酸脫氧核糖核苷,上海前塵生物科技有限公司),ddH2O(去離子水),反轉(zhuǎn)錄酶M-M uLv(MBI公司),RNA sin(RNA酶抑制劑,華美生物工程公司),Taq DNA聚合酶(寶生物工程(大連)有限公司),瓊脂糖(上海Yito企業(yè)有限公司)。

1.1.3 實驗動物 SPF雞購于梅里亞維通實驗動物中心。易感雞購自秦皇島市徳寬種雞孵化場。

1.2 方法

1.2.1 擴(kuò)增VP2高變區(qū)的引物設(shè)計方案 P1:5′-TCACCGTCCTCAGCTTAC-3′,對應(yīng)于ORFA-1第495位到512位核苷酸,長18 bp;P2:5′-TCAGGATTTGGGATCAGC-3′,互補(bǔ)于ORFA-1第1 120位到1 137位核苷酸,長18 bp;P3:5′-GCCCAGAGTCTACACCATAACTGC-3′,對應(yīng)于ORFA-1第607位到630位核苷酸,長24 bp;P4:5′-GCGACCGTAACGACAGATCC-3′,互補(bǔ)于ORFA-1第1 081位到1 100位核苷酸,長20 bp;以P3、P4為引物,所得擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)為494 bp。由張艷英老師提供。

1.2.2 病毒分離與篩選

1.2.2.1 病料處理 采集病變典型的法氏囊,以1∶3加入滅菌的PBS緩沖液,勻漿機(jī)制成乳劑,經(jīng)反復(fù)凍融3次后以3 000 r/min離心10m in,取上清液備用。

1.2.2.2 病毒篩選分離 用10 g/L瓊脂糖凝膠對流免疫電泳(CIE)試驗,對1.2.1.1中制備的囊上清液進(jìn)行篩選分離。將勻漿上清液依次判定結(jié)果。

將對流免疫電泳試驗陽性的法氏囊上清液,加入1 000單位/mL青、鏈霉素作用2 h～4 h后,滴鼻、點眼接種4周齡SPF雞0.2mL/只,接種后72 h取出感染雞法氏囊,制備上清液(方法同1.2.2.1)。

1.2.3 病毒鑒定

1.2.3.1 套式RT-PCR擴(kuò)增與氨基酸序列分析

病毒RNA提取。移取1.2.2.1中制備的囊勻漿上清0.5 mL,加入蛋白酶K至終濃度100μg/mL,100 g/L SDS至終濃度5 g/L,50℃消化1 h～2 h。等體積酚(水飽和),氯仿∶異戊醇(24∶1)各抽提1次,上層水相用2.5倍無水乙醇沉淀。沉淀用700mL/L乙醇洗2次,空氣干燥后重懸于20μL pH 8.0TE緩沖液。

反轉(zhuǎn)錄(RT)。5×反應(yīng)緩沖液4μL,DTT 2μL,P1 0.5μL(25 pmol),dNTP(10 mmol/L)1μL,病毒RNA 1μL,ddH2O 10μL?；靹?沸水中煮10 min,立即置冰浴冷卻至室溫,加入M-MuLV(200 U/μL,寶靈曼公司)0.5μL,RNasin(華美公司)1μL。混勻,瞬時離心,42℃保溫1 h。95℃5min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。

PCR擴(kuò)增與鑒定。10×PCR緩沖液5μL,dNTP(10 mm ol/L)1μL,P1 1μL(50 pmol),P2 1μL(50 pm ol),RT產(chǎn)物5μL,ddH 2 O 36.5μL,Taq酶(5 U/μL)0.5μL(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室提供)。混勻,進(jìn)入PCR循環(huán):94℃30 s;94℃30 s,55℃30 s,72℃30 s,30個循環(huán);72℃延伸10 min。取10μL反應(yīng)產(chǎn)物,10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

套式PCR(nested-PCR)擴(kuò)增與鑒定。以上述RT-PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物為模板,在內(nèi)部引物P3、P4引導(dǎo)下,對目的產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步的擴(kuò)增,反應(yīng)條件如下:10×PCR緩沖液5μL,dNTP(10mmol/L each)1μL,P3 1μL(50pmo l),P4 1μL(50 pmol),上述PCR產(chǎn)物0.5μL,ddH2O 41.0μL,Taq酶0.5μL(5 U/μL)?；靹?進(jìn)入PCR循環(huán):94℃30 s;94℃30 s,60℃30 s,72℃30 s,30個循環(huán);72℃延伸10 min。取10μL反應(yīng)產(chǎn)物,10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

氨基酸序列分析。將Nested-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。根據(jù)測定的IBDV VP2高變區(qū)cDNA序列,采用GENEman和DNA Star計算機(jī)系統(tǒng)推導(dǎo)編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列,并進(jìn)行分析比較。

1.2.3.2 回歸試驗 取上述法氏囊上清液,經(jīng)滴鼻和口服途徑感染21日齡～25日齡健康易感雞8只,對照雞4只,接種0.5mL/只,在感染后48 h～72 h剖檢觀察并記錄。

2 結(jié)果

2.1 對流免疫電泳法

被檢抗原(1.2.2.1中制備的囊上清液)8羽份,抗原孔與抗體孔均出現(xiàn)明顯沉淀線。結(jié)果為陽性。

2.2 套式RT-PCR擴(kuò)增與氨基酸序列分析

經(jīng)套式PCR再次擴(kuò)增后,取5μL反應(yīng)產(chǎn)物電泳檢測。在約490 bp大小處,被檢毒株均可見一條與預(yù)期的產(chǎn)物大小相符的條帶,而且陰性對照和空白對照均沒有條帶出現(xiàn),符合預(yù)期結(jié)果(圖1)。

根據(jù)高變區(qū)內(nèi)氨基酸同源性,用平均距離法和聚類程序PXD,作出秦皇島毒株與已發(fā)表的國際標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株的親緣關(guān)系樹狀圖譜(圖2)。從樹狀圖上比較容易發(fā)現(xiàn),HeB-qhd與超強(qiáng)毒株OKYM,UK 661,DV 86最相近同源性高達(dá)100%,具有強(qiáng)毒特征的毒株HeB-qhd與V 3、V 2親緣關(guān)系較近(97.9%～99.3%)。對收集的毒株進(jìn)行了VP2高變區(qū)序列分析,和有關(guān)文獻(xiàn)報道的超強(qiáng)毒株進(jìn)行了對照,發(fā)現(xiàn)H eB-qhd毒株具備了超強(qiáng)毒的3個典型的特征:①249位和254位的氨基酸分別為Q和G,而非K和S,從而保證其抗原性不發(fā)生變異;②七肽區(qū)保守SWSASGS不變,且279位和284位氨基酸分別為D和A,而非N和T;③222、294、299位具有3個特征性氨基酸,分別為A、I和S,這3個氨基酸使得超強(qiáng)毒株的親和性發(fā)生變化,從而導(dǎo)致毒力大大增強(qiáng)。通過比較分析待檢毒株為超強(qiáng)毒株。

圖1 VP2高變區(qū)的反轉(zhuǎn)錄PCR/套式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 VP2 hypervariab le region of RT-PCR/nest RT-PCR

圖2 秦皇島IBDV毒株與已發(fā)表的國際標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株的氨基酸序列樹狀圖Fig.2 The am ino acid sequen ce tree of Qinhuangdao IBDV strains and the in ternational standard virulent strains

本試驗所測秦皇島毒株其主要的氨基酸變化同幾個國際上標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株的VP2高變區(qū)推測的氨基酸序列見表1。

表1 秦皇島IBDV分離株與參考毒株在VP2高變區(qū)的特征性氨基酸Table 2 The characteristic amino acids of Qinhuangdao IBDV isolate and reference strains in the VP2 hypervariable region

2.3 回歸試驗

人工接種21日齡～25日齡易感雞36 h開始發(fā)病,8只試驗易感雞全部發(fā)病,4只對照雞不發(fā)病,發(fā)病雞排出灰白色稀糞,羽毛蓬松、戰(zhàn)栗。剖檢可見,法氏囊黏膜嚴(yán)重出血,呈“紫葡萄”樣外觀,剖開可見出血或有淡黃色的膠凍樣滲出液。腿部、胸部肌肉有嚴(yán)重出血,腺胃與肌胃交界處出現(xiàn)嚴(yán)重的帶狀出血。

3 討論

近年來,IBD的流行出現(xiàn)了新的特點,其臨床癥狀及病變不典型,免疫失敗現(xiàn)象較為常見,超強(qiáng)毒(vvIBDV)成為主要流行毒株。因此,對本病的早期確診就顯得尤為重要。目前用于檢測IBDV的方法有瓊脂擴(kuò)散試驗(AGP)、對流免疫電泳(CIE)、間接血凝試驗、ELISA、中和試驗和PCR技術(shù)等,但由于試驗條件和試驗成本等因素限制,只有免疫擴(kuò)散法真正得到推廣應(yīng)用。瓊脂擴(kuò)散法雖然簡便易行,但其敏感性和特異性都不高,而且必須在試驗后24 h～48 h才能觀察結(jié)果。

對流免疫電泳(CIE)是將雙向免疫擴(kuò)散與電泳相結(jié)合的一種技術(shù)。用CIE試驗,抗原和抗體分別受電泳力和電滲力的作用呈定向相對泳動,既加速了反應(yīng)的出現(xiàn),也限制了抗原和抗體向四周自由擴(kuò)散的傾向,因而提高了敏感性。用CIE方法只需30 min～60 min就出結(jié)果,而且特異性高,重復(fù)性好,檢測效果明顯好于瓊擴(kuò)法。

PCR技術(shù)作為RNA病毒的一種特異診斷方法,具有快速、特異、靈敏等特點。RNA酶在環(huán)境中無處不在,為防止操作過程中提取RNA不被環(huán)境中的RNA酶降解,試驗在操作過程中嚴(yán)格無菌,操作人員戴一次性口罩、帽子、手套,實驗過程中手套要勤換。本試驗在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化,擴(kuò)增效果理想,采用外引物、內(nèi)引物進(jìn)行套式RT-PCR,靈敏性和特異性較好。所以可用該方法進(jìn)行臨床樣品快速診斷雞傳染性法氏囊病,并對該病的流行病學(xué)調(diào)查有重大意義。

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