日本櫻花莖段再生體系的建立

何月秋,王志龍,池樹友

(1.寧波城市職業(yè)技術(shù)學(xué)院環(huán)境學(xué)院,浙江寧波 315502;2.寧波森林病蟲害檢驗(yàn)檢疫站,浙江寧波 315502)

日本櫻花(Prunus yedoensis Matsum)隸屬薔薇科李屬[1],其花色幽香艷麗,盛開時(shí)節(jié)花繁艷麗,滿樹爛漫,如云似霞,極為壯觀,是人們所喜愛的木本花卉之一。隨著我國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的提高,名貴日本櫻花走俏市場,苗木供不應(yīng)求。傳統(tǒng)的日本櫻花營養(yǎng)繁殖方法繁殖速度慢,并且有嚴(yán)重的根癌病[2]。感病后櫻花植株根系發(fā)育不良,地上部分生長緩慢,樹勢衰弱,嚴(yán)重時(shí)葉片黃化,早落,甚至全株枯死。該病嚴(yán)重影響苗圃苗木的質(zhì)量和果園樹體的整齊度,重茬苗圃發(fā)病率在 20%～100%,嚴(yán)重的甚至造成毀園。到目前櫻花根癌病尚未找到經(jīng)濟(jì)、有效的化學(xué)或物理的方法來防治,這給廣大種植戶造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,大大挫傷了農(nóng)民的積極性。研究表明,種植抗病品種是綜合防治該病的有效途徑,可有效抵抗根癌菌的侵染[3]。然而抗性品種的數(shù)量有限,在生產(chǎn)中迫切需要一條簡便、快捷的技術(shù)來加快抗病材料的大量繁殖。植物組織培養(yǎng)技術(shù)是快速繁殖優(yōu)良樹種的理想途徑,同時(shí)也是通過遺傳操作獲得轉(zhuǎn)基因植物,從而改良樹種的前提條件[4]。開展櫻花抗根癌病組織培養(yǎng)技術(shù)研究,將有利于加速抗病良種的推廣進(jìn)程。

國內(nèi)黃宇翔等對福建山櫻花(Prunus campanulata Maxim)的組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)的研究,并建立了規(guī)?；敝丑w系[5～7]。王永清等對嫁接在櫻桃上的兩年生櫻花幼樹進(jìn)行取材,獲得了日本櫻花的叢生芽[8];而姚連芳等也對櫻花的組培技術(shù)進(jìn)行了研究,獲得了可喜的技術(shù)成果[9]。筆者參考相關(guān)資料,建立了日本櫻花組培快繁技術(shù)體系,為進(jìn)一步開展櫻花抗根癌病育種工作提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

于 2008年 3月 ～2009年 3月,在不同季節(jié)取成年日本櫻花當(dāng)年抽出的新梢為外植體,材料源于寧波四明山日本櫻花種植基地。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 外植體的滅菌

方法 1:取日本櫻花新梢中上部發(fā)育充實(shí),尚未萌發(fā)抽生兩次新梢的腋芽,在流水中沖洗 24 h,用70%乙醇和 0.1%HgCl2(加適量吐溫 -20)滅菌,處理方法見表 1。

方法 2:先用自來水沖洗干凈同一天早上、中午、晚上采摘的外植體的表面,剪去老枝及葉片,用洗潔凈溶液浸泡 10 min,在用刷子蘸洗潔凈溶液清清刷洗腋芽及莖段,將刷洗好的芽按自然生長方向置于燒杯中待用。采摘時(shí)間分別為:早上 7:00;中午 12:00;晚上 19:00。

方法 3:先用自來水沖洗干凈同一天中午 12:00采摘的外植體的表面,剪去老枝及葉片,用洗潔凈溶液浸泡 10min,在用刷子蘸洗潔凈溶液清清刷洗腋芽及莖段,將刷洗好的芽按自然生長方向置于燒杯中,基部用滅過菌的濾紙包裹,套上保鮮袋,放入4℃的冰箱低溫冷藏待用。冷藏時(shí)間分別為:1 d、2 d、3 d和 4 d。

以上材料經(jīng)過無菌處理后均接種至:MS+NAA 0.05mg? L-1+6-BA2.0mg? L-1誘導(dǎo)培養(yǎng)基中[9～10]。

表 1 不同滅菌方法對日本櫻花外植體的影響

1.2.2 最適合培養(yǎng)條件的篩選

將獲得的已經(jīng)萌芽的莖段置于附加有不同種類、濃度植物激素的培養(yǎng)基上,觀察各種因子對日本櫻花叢生芽增殖、叢生芽生長以及生根的影響。

1.3 培養(yǎng)條件

經(jīng)過滅菌處理后的離體材料培養(yǎng)于 200ml的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行光照培養(yǎng)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基的基本培養(yǎng)劑為 MS,白糖為 30 g?L-1,而在生根階段,基本培養(yǎng)基為 1/2MS,白糖為 15 g?L-1。在整個培養(yǎng)過程中,pH值為 5.8,溫度 25℃ ±1℃、光照強(qiáng)度為 40μmol?m-2? s-1、每日光照 14 h的條件下培養(yǎng)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

接種 1周后統(tǒng)計(jì)污染率,1個月后統(tǒng)計(jì)褐變率(褐變率 =褐變外植體數(shù)/未污染外植體數(shù) ×100%),每種處理不少于 30個外植體,重復(fù) 3次。莖段在分化培養(yǎng)基上培養(yǎng) 30 d后,統(tǒng)計(jì)其分化率(分化率 =腋芽生長的莖段數(shù)/接種的總莖段數(shù) ×100%),腋芽在增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí),統(tǒng)計(jì)其增殖系數(shù)(增殖系數(shù) =叢生芽總數(shù)/接種腋芽總數(shù)),每種處理至少 30個外植體,重復(fù) 3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 日本櫻花無菌材料的獲得

將不同滅菌方法處理的日本櫻花莖段接入1/2 MS培養(yǎng)基中,每天觀察外植體的污染狀況作好記錄。接種 10 d以后,外植體的污染狀況基本穩(wěn)定。從表 1所反映的結(jié)果可以看出,日本櫻花無菌體系比較難建立。主要因?yàn)榍o段帶菌量大,同時(shí)成年枝條葉腋部不容易消毒,且保護(hù)物質(zhì)較多從而導(dǎo)致絕大多數(shù)外植體出現(xiàn)褐化、壞死現(xiàn)象,因此外植體的存活問題成為系統(tǒng)研究日本櫻花組織培養(yǎng)的重要障礙。實(shí)驗(yàn)表明,采用乙醇和升汞混合使用的方法時(shí),盡管隨著兩種滅菌劑處理的時(shí)間加長,污染率有所下降,但莖段均全部褐化。通過不同滅菌時(shí)間的篩選研究可知,70%乙醇處理 3 min、0.1%HgCl2處理10分鐘是較為理想的消毒處理方式,污染率相對較低為 36.7%,而褐化程度最輕。而 70%乙醇處理 4 min、0.1%HgCl2處理 10 min,雖然污染率最低,僅有 10%,但莖段全部壞死。

針對日本櫻花莖段滅菌后易褐化的現(xiàn)象,從外植體材料的處理入手探討建立日本櫻花無菌培養(yǎng)物的方法。由表 2結(jié)果可知,取材時(shí)間的不同、外植體冷藏時(shí)間的不同對日本櫻花初代培養(yǎng)無菌莖段的獲得有重要的影響。實(shí)驗(yàn)表明,中午 12:00取材褐化率最低;冷藏時(shí)間越長滅菌后材料的褐化率越低,但冷藏時(shí)間過長容易導(dǎo)致莖段不能萌芽。一般而言,將在中午 12:00采集的莖段冷藏 2d,經(jīng)過滅菌處理可獲得少數(shù)可長出腋芽的無菌莖段。

2.2 激素種類及其濃度對日本櫻花叢生芽增殖的影響

將抽出的腋芽連同莖段轉(zhuǎn)接到添加有不同濃度的 6-BA、NAA和 GA3的 MS培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)。在適宜的增殖培養(yǎng)基中,腋芽不但能夠迅速增殖,而且形成的新芽能夠同時(shí)長大,接種后 30 d,新芽伸長 2 cm～2.5 cm,每芽的葉片數(shù)可達(dá)到 6片 ～8片,且葉色嫩綠。形成的新芽繼續(xù)以單芽或叢芽的方式繼續(xù)轉(zhuǎn)接至增殖培養(yǎng)基中,又可形成叢芽,如此反復(fù),可在短期內(nèi)獲得大量的櫻花叢生芽。表 3表明,培養(yǎng)基中添加的激素濃度和種類的不同,對日本櫻花增殖有較大影響。低濃度的 6-BA不利于日本櫻花叢生芽的增殖,這與福建山櫻花叢生芽增殖所用的激素水平不一致[7],這可能與取材以及基因有關(guān)。而當(dāng)培養(yǎng)基 NAA濃度為 0.4 mg?L-1時(shí)則出現(xiàn)嚴(yán)重的愈傷組織,但 NAA在 0.2 mg?L-1時(shí)盡管有少量愈傷組織,但形成的叢生芽生長緩慢,且莖段很難伸長。添加適當(dāng) GA3時(shí)則可促進(jìn)叢生芽的分化和莖段伸長,但濃度高時(shí)則容易形成大量愈傷組織。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,MS+6-BA4 mg?L-1+NAA 0.34mg? L-1+GA30.05mg? L-1是日本櫻花叢生芽增殖的最佳組合,增殖系數(shù)可達(dá)到 6.3。

表 2不同預(yù)處理改善日本櫻花莖段褐化效果

表 3 外源激素對櫻花叢生芽增殖的影響

2.3 日本櫻花組培苗根的誘導(dǎo)

將生長至 3 cm～3.5 cm的日本櫻花叢生芽轉(zhuǎn)移至大量元素減半的、添加有不同濃度生長素的生根培養(yǎng)基中。結(jié)果表明,一定濃度IBA和 NAA同時(shí)使用可大大提高日本櫻花組培苗的生根率見表 4。由表 4可知,只添加 0.2 mg?L-1IBA時(shí),組培苗的生根率很低,僅有 30.2%,且形成的根細(xì)小,生長緩慢;當(dāng)培養(yǎng)基加入一定濃度的 NAA時(shí),日本櫻花組培苗生根率顯著提高。實(shí)驗(yàn)表明,當(dāng) IBA一定時(shí),組培苗的生根率隨著 NAA濃度的增加而增加,但組培苗切口愈傷組織也隨之嚴(yán)重。綜合分析認(rèn)為:1/2 MS+IBA 0.2mg? L-1+NAA0.6mg? L-1是福建櫻花組培苗最佳的生根培養(yǎng)基。在此培養(yǎng)中,組培苗的生根率可達(dá)到 90.1%,且愈傷組織少,根粗壯,煉苗時(shí)容易成活。

表 5 外源激素對櫻花叢生芽增殖的影響

3 結(jié)語

利用成齡植物莖段作為外植體建立日本櫻花離體培養(yǎng)系統(tǒng),遇到的主要問題為外植體容易污染、易褐化死亡、叢生芽莖段不易伸長等,克服這些障礙是建立櫻花再生體系的關(guān)鍵技術(shù)。

污染和褐化是植物組織培養(yǎng)過程中主要困難,許多學(xué)者進(jìn)行了深入研究,但至今還未找到單一有效的方法來克服這些問題[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,采用較長時(shí)間的 75%酒精浸泡和 0.1%升汞處理可獲得部分無菌的莖段,而在中午取材、4℃冰箱冷藏處理 2 d可獲得 8.7%長出腋芽的無菌莖段。這樣處理一方面可利用酒精的滲透力使得升汞滲入莖段腋芽部分,另一方面還有充分發(fā)揮酒精本身的殺菌效果,但酒精和升汞處理時(shí)間太長易導(dǎo)致外植體材料死亡。而特定時(shí)間取材和將材料進(jìn)行冷處理可減少外植體本身抑制物質(zhì)的產(chǎn)生,降低滅菌后材料的褐化率和死亡率。

一般而言,叢生芽的增殖研究是植物組培再生體系建立的關(guān)鍵環(huán)節(jié),是植物快速增殖的根本。本研究表明,高濃度的細(xì)胞分裂素有利于日本櫻花腋芽的增殖:6-BA濃度在 4mg?L-1、NAA濃度為0.3mg?L-1可獲得增殖系數(shù)高、生長旺盛的叢生芽;當(dāng) NAA濃度在 0.4mg?L-1以上時(shí)則容易導(dǎo)致叢生芽形成大量愈傷組織,低于 0.2 mg?L-1時(shí)叢生芽生長緩慢,這與姚連芳[9]得出 6-BA濃度 0.5 mg?L-1～3.0 mg? L-1,NAA0.05 mg? L-1～0.3 mg?L-1這一結(jié)論不相符合。其中的差異有可能與實(shí)驗(yàn)所選擇的材料不同有關(guān)。同時(shí),日本櫻花的叢生芽莖段不易伸長,這現(xiàn)象在 Prunus屬其它植物上也有報(bào)道[12],在培養(yǎng)基中添加加一定 0.05mg?L-1GA3,就可得到解決。

植物激素中,生長素對根的形成具有重要作用[13]。在一定范圍內(nèi),試管苗的生根率與生長素在培養(yǎng)基中的含量呈正相關(guān);過量時(shí),則會形成大量的愈傷組織團(tuán)塊而導(dǎo)致輸導(dǎo)組織不暢,影響苗木生長和移栽成活。本實(shí)驗(yàn)表明:NAA大于 0.8 mg?L-1時(shí),日本櫻花組培苗切口處形成大量愈傷組織;而單獨(dú)使用 IBA不利于根的形成。在本實(shí)驗(yàn)體系中,1/2MS+IBA 0.2 mg? L-1+NAA 0.6 mg? L-1是日本櫻花組培苗理想的生根培養(yǎng)基,生根率可達(dá)到90.1%。

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