農(nóng)家酸菜中乳酸菌的分離與產(chǎn)酸性能研究

閆 肅, 呂嘉櫪

(陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 前 言

農(nóng)家酸菜一直以來備受人們的喜愛，以其營養(yǎng)豐富、味道鮮美、色澤光亮、制作簡單而備受青昧.酸菜發(fā)酵過程屬于乳酸菌發(fā)酵的一種，產(chǎn)生了許多有益物質(zhì)，降低了發(fā)酵液的pH值，并抑制了其他有害菌，使酸菜香味獨特.但農(nóng)家酸菜常在食用泡菜后將發(fā)酵液倒掉，造成了可循環(huán)利用的有益物質(zhì)浪費[1].由于酸菜的此種特質(zhì)，所以研究發(fā)酵液中乳酸菌的產(chǎn)酸性能對于酸菜的口感和產(chǎn)酸菌菌種的篩選具有重要的意義.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸菜發(fā)酵液采集于陜西戶縣農(nóng)村.

MRS培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨l0 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，檸檬酸鈉5 g，磷酸氫二鉀2 g，乙酸鈉5 g，MgSO40.58 g，MnSO40.25 g，吐溫80 mL，蒸餾水1 000 mL.

1.2 實驗儀器

VS-1300～U型潔凈工作臺，LZD～4自動立式高壓蒸汽滅菌鍋，PHS-25酸度計，GNP9160恒溫生化培養(yǎng)箱，101-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱，BS224S電子天平， UV-2600紫外可見分光光度計，SMART生物顯微鏡.

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化[2]

因乳酸菌主要集中在發(fā)酵酸菜汁中，所以分離前需要進行增值培養(yǎng).活化酸菜汁中的乳酸菌，以1%接種量將酸菜汁接入到MRS液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，并于37 ℃隔水式恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進行厭氧培養(yǎng)24 h.按以上方法傳代培養(yǎng)3次.

1.3.2 菌種篩選[3]

將各代活化的樣品用無菌生理鹽水稀釋10-1～10-6倍，分別吸取0.1 mL涂布于培養(yǎng)皿中，上面覆一層含有無水碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫培養(yǎng)36～48 h.挑取長勢優(yōu)良且溶鈣圈大的菌落反復(fù)進行分離純化，直至得到純菌落為止，并將得到的菌落編號保存?zhèn)溆?

1.3.3 pH值測定

用PHS-25型酸度計直接測定，測定時間與酸度同步.

1.3.4 酸度測定[4]

用移液管準(zhǔn)確量取5 mL發(fā)酵菌液，用去離子水定容至100 mL，取50 mL搖勻后向發(fā)酵菌液中加入2～3滴酚酞指示劑，用0.1 mol/L NaOH進行滴定，至微紅色30 s不褪色即可.酸度計算公式：

酸度(以乳酸計)=c(v-V)×0．09×k×100/W

其中，c：消耗NaOH溶液的摩爾濃度；v：標(biāo)定時所消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積；V：空白試驗中所消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積；k:稀釋倍數(shù);W：樣品質(zhì)量或毫升數(shù)；0.09：換算為乳酸的系數(shù)，即1 mmol NaOH相當(dāng)于乳酸的克數(shù).

1.3.5 生長曲線測定

將活化菌種接種于MRS試管液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)48 h，按1%接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基三角瓶中，于37 ℃恒溫培養(yǎng).前24 h每間隔3 h取5 mL發(fā)酵液，后24 h每隔5 h測其OD600值，以時間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)作圖，得到該菌株的生長曲線.

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種初篩選

菌株的產(chǎn)酸高低與溶鈣圈的大小呈正相關(guān)，由此挑選出5株產(chǎn)酸能力較強的菌株并編號，分別為Lab.1、Lab.2、Lab.3、Lab.4、Lab.5.

2.2 菌落觀察

形態(tài)特征：將分離純化的菌種分別涂到 MRS瓊脂培養(yǎng)基上, 于37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落特征,取典型菌落涂片革蘭氏染色,油鏡下觀察菌體形態(tài)，發(fā)現(xiàn)菌株呈桿狀、半球狀突起成對或串聯(lián)，數(shù)量較多，如圖1～圖5所示.由圖中可見，在MRS瓊脂培養(yǎng)基上的生長特性基本一致，菌落呈白色，圓形，中央凸起，表面光滑，質(zhì)地均勻，而且在挑取菌體時都有一定的黏性，表面凹凸不平，菌落呈淡黃色.

根據(jù)菌株形態(tài)和菌落特征觀察，初步確定所得到菌株為桿菌[5].

圖1 Lab.1菌體形態(tài) 圖2 Lab.2菌體形態(tài) 圖3 Lab.3菌體形態(tài)

圖4 Lab.4菌體形態(tài) 圖5 Lab.5菌體形態(tài)

2.3 菌株的生長曲線

圖6 菌株的生長曲線 圖7 發(fā)酵過程中pH的變化情況

從圖6可知，Lab.1～Lab.4的生長狀況明顯優(yōu)于Lab.5.對于菌株在MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，0～5 h為延遲期，5～20 h為對數(shù)生長期，20 h以后生長基本趨于穩(wěn)定.

2.4 菌株的pH和產(chǎn)酸曲線

圖8 產(chǎn)酸實驗結(jié)果

由圖7和圖8可以看出：Lab.1、Lab.2和Lab.3的產(chǎn)酸能力相似且產(chǎn)酸速度較快，pH由5.5降為4.0. Lab.2產(chǎn)酸量最高，Lab.5產(chǎn)酸最慢且最低，Lab.4次之.酸菜食用時間與乳酸菌的發(fā)酵時間關(guān)系密切,若前期食用， 咸而不酸； 若后期食用， 酸而不咸，失去酸菜風(fēng)味， 酸度達到1.2～1.4時為酸菜的最佳食用期[4].篩選出的Lab.1～Lab.4菌株15 h即可達到最佳食用期，大大縮短了發(fā)酵時間，提高了生產(chǎn)效率.

3 結(jié)束語

通過對傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜中優(yōu)勢乳酸菌的分離初篩，選出5株溶鈣圈大、長勢優(yōu)良的菌株，通過形態(tài)學(xué)觀察初步確定為乳酸桿菌，并對其產(chǎn)酸性能進行了研究.在產(chǎn)酸試驗中Lab.1、Lab.2和Lab.3的產(chǎn)酸和長勢差別不是很大，Lab.4較弱，Lab.5最低，從而對于民間酸菜的發(fā)酵和產(chǎn)酸狀況有了初步了解.篩選出的菌株Lab.2由于其產(chǎn)酸量較高，可以對其做進一步的發(fā)酵研究.本試驗可以作為研究農(nóng)家泡菜發(fā)酵液的應(yīng)用效果和作用機理的一部分，為今后進一步研究酸菜發(fā)酵液的性能奠定了基礎(chǔ)，同時明確了農(nóng)家泡菜發(fā)酵液不應(yīng)是一種廢棄物，而是一種具有很高利用價值的微生態(tài)調(diào)節(jié)系統(tǒng).

參考文獻

[1] 李文斌,唐中偉,宋敏麗,等．農(nóng)家泡菜發(fā)酵液中乳酸菌的研究[J].食品工程，2009， 3(9)：38-40．

[2] 諸葛?。I(yè)微生物實驗技術(shù)手冊[M]．北京：中國輕工業(yè)出版社，2003.

[3] 吳元鋒，鄒禮根．泡菜中乳酸菌的分離、鑒定及其發(fā)酵性能研究[J]．中國食品學(xué)報，2007，7(5)：42-46．

[4] 黃 群， 麻成金， 余 佶,等，龍山大頭菜乳酸菌的分離與鑒定[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué),2009 ， (9)： 11-13.

[5] 東秀珠，蔡妙英．常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]．北京：科學(xué)出版社，2001.

[6] 伍時華，黃翠姬，石媛靖，等．酸乳菌種分離純化方法[J]．食品科學(xué)，2004，25(10)：162-166．

[7] 王艷梅，馬儷珍．泡菜汁中乳酸菌的分離與初步鑒定[J]．天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報，2007，14(3)：5-8．