木棗病原真菌抑菌試驗研究

劉 青, 許牡丹, 曾令軍, 劉 艷

(陜西科技大學生命科學與工程學院, 陜西 西安 710021)

0 前 言

果蔬采后因貯藏溫度、濕度不適而極易腐爛變質.木棗由于其質構緊密，含水量少，采后極易酒化變質，采后病害是影響貯藏的重要因素，但由于品種多、貯藏環(huán)境不同，因此許多研究了者分離鑒定的致病菌不盡相同.有研究報道鮮棗在生產(chǎn)和貯藏過程中引起病害的病原菌主要有鏈格孢菌、擬莖點霉菌、歐氏干菌、梭殼孢菌、根菌索菌、根霉菌等[1].本試驗從木棗貯藏后期分離出致病菌，用可食中草藥做抑菌劑，研究了其對木棗病原菌的抑菌效果以及最佳的浸提劑和溶劑.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料：丁香、良姜、苦參、甘草購于西安市未央?yún)^(qū)景家中西藥店.菌種：青霉和酵母菌，在生命學院實驗室從病變的鮮棗組織中分離純化得到.培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基.

1.2 儀器與設備

超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)，電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(成都紅星電烘箱廠)，手提式壓力滅菌鍋(浙江新豐醫(yī)療器械有限公司)，旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，BK5000型奧特偏光顯微鏡(重慶奧特光學儀器有限公司).

1.3 試驗方法

1.3.1 木棗病原菌的分離[2]

將貯藏過程中發(fā)病的木棗病果表面用水清洗,然后切取與病害鄰近的4～5 mm見方的組織小塊,用體積分數(shù)75%的酒精浸泡30 s,迅速用滅菌濾紙吸出酒精后移入2%的次氯酸鈉溶液中浸泡1 min，再用無菌水沖洗3次,用消毒濾紙吸干表面水分,最后將組織小塊接在PDA培養(yǎng)基上于25～28 ℃下培養(yǎng)3～5 d,當培養(yǎng)出的菌落直徑為1 cm時,用接種針挑取菌落邊緣菌絲接入另一PDA培養(yǎng)皿上,并于25～28 ℃培養(yǎng).重復上述操作3次,所得菌落即可作為純化菌種回接果實,如發(fā)病癥狀與前相同,便可作為采后病原菌轉接入試管,4 ℃冰箱保存,作為供試菌種進行進一步鑒定.

1.3.2 木棗病原菌的鑒定

根據(jù)病害癥狀、菌落形態(tài)及菌絲、孢子等的特征來確定感染木棗的病原真菌.

1.4 植物粗提物的制備

將4種中草藥原料粉碎后，過40目篩，分別稱取2.0 g粉末，用溶劑浸提丁香、良姜、苦參和甘草，于60 ℃的恒溫振蕩儀中振蕩24 h，濾液于旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮，再用不同溶劑定容濃縮液至100 mL，使最后質量濃度相當于20 mg/mL.

(1)水提水溶中草藥：按粗提物制備方法，用水做溶劑，濃縮后用水定容至100 mL.

(2)醇提水溶中草藥：方法同上，用70%乙醇做溶劑，濃縮后用水定容至100 mL.

(3)醇提醇溶中草藥：方法同上，用70%乙醇做溶劑，濃縮后用20%乙醇定容至100 mL.

(4)醇提油溶中草藥：方法同上，用70%乙醇做溶劑，濃縮后用20%丙三醇(甘油)定容至100 mL.

1.5 菌懸液制備

將分離純化的菌種接入平板培養(yǎng)基上，在28 ℃培養(yǎng)5 d，進行活化，然后挑1環(huán)菌放入9 mL 0.9%無菌生理鹽水中，震蕩搖勻，制成濃度約為107～108 cfu/mL的菌懸液.

1.6 抑菌劑篩選

取直徑為6 mm濾紙圓片，放入到抑菌劑溶液中，浸泡30 min，取出晾干.用注射器吸取菌懸液0.6 mL于平板培養(yǎng)基上，將晾干的濾紙片貼在培養(yǎng)基表面，每皿3片，重復3次，在28 ℃培養(yǎng)28～72 h，取出測量抑菌圈直徑，取平均值，篩選有效的抑菌劑.

2 結果與討論

2.1 病原菌鑒定

從貯藏的木棗果實上分離出 A、B兩種病原真菌，挑取各菌落少許到載玻片上，用顯微鏡觀察、測量，根據(jù)各病原菌的形態(tài)特征對其進行鑒定.

(1)病原真菌A.培養(yǎng)該菌，在PDA培養(yǎng)基上菌落如圖1所示，菌落呈圓形，青綠色，粉狀霉層菌落，菌落邊緣白色.顯微鏡觀察可見分生孢子梗叢生，量大，小梗為瓶形梗，孢子大小均勻，近球形或橢圓形.細胞形態(tài)在400倍光學顯微鏡下觀察如圖2所示，根據(jù)以上特征及文獻[3],鑒定病原菌為青霉屬.

圖1 青霉菌菌落 圖2 青霉菌孢子梗

(2)病原真菌B.培養(yǎng)該病原菌的菌落如圖3所示，菌落呈現(xiàn)乳白色，少數(shù)為紅色，表面光滑濕潤，質地柔軟不透明，菌落直徑為1～2 mm.孢子為圓形，單生或成串，有的正以出芽生殖.細胞形態(tài)在400倍光學顯微鏡下觀察如圖4所示，經(jīng)鑒定為酵母菌類.

圖3 酵母菌菌落 圖4 酵母菌細胞形態(tài)

2.2 天然植物提取液對病原菌的抑制作用

2.2.1 青霉抑菌圈的測定結果

對青霉有抑制效果的植物提取液及其抑菌圈直徑見表1.

表1 不同處理方式抑菌直徑(mm)

從表1可知，用水做浸提劑的4種中草藥，青霉抑菌圈直徑最大的為甘草，10.25 mm，其次為丁香水提液，良姜水提液的效果最差；用70%乙醇做浸提劑，后用水定容的中草藥提取液，抑菌效果最佳的為甘草，抑菌圈直徑為13.17 mm，其次為苦參提取液，最差的為丁香醇提水溶液；而用乙醇提取，用20%乙醇定容的中草藥提取液，抑菌效果最佳的為丁香，最差的為苦參；用20%丙三醇定容的中草藥提取液，抑菌圈直徑最大的為丁香提取液，效果最差的為甘草提取液.

同一種中草藥，用不同的溶劑提取定容，數(shù)據(jù)顯示丁香抑制青霉效果最好的為70%乙醇提取后用20%丙三醇定容，可能是丁香的主要抑菌成分為油溶性的，丁香揮發(fā)油中主要含有丁香酚、丁香醇、茴香醚等多種成分[4].關文強[5]等人研究報道600 mg/L的丁香精油能夠完全抑制葡萄灰霉菌、鏈格孢、冬棗青霉的生長，而良姜的成分可能有油溶的，也有水溶的，所以其醇提水溶和醇提甘油溶的抑菌圈直徑相差不大，甘草和苦參的都是醇提水溶效果好.張顯忠[6]等人報道，多數(shù)中草藥有效成分提取以醇提法最優(yōu), 醇提法更有效的作用極可能是由于提取液中除了水溶性的成分還有水不溶的酯類等有效成分.

2.2.2 酵母菌抑菌圈的測定結果

表2 不同處理方式抑菌圈直徑(mm)

由表2可得，水提水溶的中草藥提取液，苦參的抑菌圈直徑最大，其次是甘草；70%乙醇提取，濃縮后，用水做溶劑的提取液中苦參的抑菌效果最佳，抑菌圈直徑為9.60 mm，效果最差的為丁香提取液；70%乙醇浸提，20%乙醇定容的提取液，甘草的酵母抑菌效果比較好，最差的為苦參；醇提20%丙三醇定容的中草藥提取液，抑菌圈直徑最大的為甘草，為10.63 mm，效果最差的為丁香提取液.

同一種中草藥，不同的提取溶劑，丁香、良姜和甘草的醇提醇溶提取液抑菌效果最佳；苦參的醇提水溶效果略好.

3 結論

3.1 青霉抑菌效果

(1)通過分離鑒定青霉菌，同種提取溶劑的不同中草藥的抑菌結果為，水提水溶抑菌效果：甘草>丁香>苦參>良姜；醇提水溶的抑菌直徑大小排序：甘草>苦參>良姜>丁香；醇提醇溶抑菌圈直徑依次為丁香>良姜=甘草>苦參；醇提油溶效果：丁香>苦參>良姜>甘草.

(2)同一種中草藥，用不同的溶劑提取定容，丁香抑制青霉效果最好的為70%乙醇提取后用20%丙三醇定容；良姜醇提水溶和醇提油溶的抑菌效果區(qū)別不大；甘草和苦參的都是醇提水溶效果好.

3.2 酵母抑菌效果

(1)同種提取溶劑，不同中草藥抑菌效果為，水提水溶的中草藥提取液抑菌圈：苦參>甘草>丁香>良姜；醇提水溶抑菌效果：苦參>良姜>甘草>丁香提取液；醇提醇溶抑菌直徑：甘草>丁香>良姜>苦參；醇提油溶抑菌圈直徑：甘草>良姜>苦參>丁香提取液.

(2)同一種中草藥，不同的浸提劑和溶劑，丁香、良姜和甘草的醇提醇溶提取液抑菌效果最佳；苦參的醇提水溶效果略好.

參考文獻

[1] 劉萬臣,關文強,劉興華，等.3種鮮棗貯藏期治病真菌的檢測及定性研究[J].食品科技,2007,(8)：237-240.

[2] 許 玲,李學文,騰康寧. 果蔬采后致病真菌的檢測及其控制[J].食品科學,2003,24(7):155-158.

[3] 魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海:上?？茖W技術出版社,1979:358-552.

[4] 郭松年,井澤良,孫海燕，等. 丁香提取物對三種果實致腐真菌的抑制作用研究[J].食品研究與開發(fā),2006,27(3):160-161.

[5] 關文強,李淑芬.丁香精油對果蔬采后病原菌抑制效應研究[J].食品科學,2005,26(12):227-230.

[6] 張顯忠,郭愛軍,王德才，等.丁香等中草藥有效成分的提取方法和抗菌活性關系的研究[J].泰山醫(yī)學學報,2008,29(10):760-763.