培養(yǎng)方法對(duì)發(fā)菜細(xì)胞中多糖和蛋白含量影響的研究

陳雪峰, 王 岳

(陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 前言

發(fā)菜(NostocFlagelliforme)是發(fā)狀念珠藻的簡(jiǎn)稱，隸屬藍(lán)藻門，主要生長(zhǎng)在干旱、半干旱地區(qū)的部分荒漠草原和荒漠地帶，是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高的食用性藍(lán)藻[1].發(fā)菜在其生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)向胞外分泌大量的多糖物質(zhì)，發(fā)菜多糖具有很高的親水性，有利于發(fā)菜在干旱環(huán)境中生長(zhǎng)，并能對(duì)其起到保護(hù)作用[2].日本微細(xì)藻類綜合研究所和富山醫(yī)科藥科大學(xué)的藥理試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)菜多糖對(duì)單純皰疹病毒等具有明顯的抗病毒活性[3].近年來(lái)，發(fā)菜成為了一種引人注目的新型產(chǎn)多糖資源，而有關(guān)發(fā)菜中蛋白質(zhì)的研究也逐漸增多.

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)選擇不同潤(rùn)濕性的固體基質(zhì)以及不同的培養(yǎng)方法,對(duì)發(fā)菜細(xì)胞生長(zhǎng)狀況及不同培養(yǎng)過(guò)程中分泌的莢膜多糖、胞外多糖含量及蛋白質(zhì)生成進(jìn)行了研究,以期為發(fā)菜培養(yǎng)和發(fā)菜細(xì)胞中有效成分的提取分離提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 發(fā)菜細(xì)胞

野生發(fā)狀念珠藻于2002年采于寧夏賀蘭山東麓，發(fā)狀念珠藻細(xì)胞種由天津科技大學(xué)工業(yè)微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏2年.將發(fā)菜原植體經(jīng)光合活性恢復(fù)，勻漿法分離單體細(xì)胞，純化后，收集細(xì)胞，重新懸浮于新鮮BG11培養(yǎng)基中，備用.

1.1.2 固體培養(yǎng)基質(zhì)

選取粗沙(粒徑>0.83 mm)、玻璃渣(粒徑>0.83 mm)和PA6(尼龍6)3種不同潤(rùn)濕性的固體基質(zhì)，用水洗滌干凈，烘干，添加量以平鋪至Ф90 mm培養(yǎng)皿5 mm高度為宜，即粗沙和玻璃渣每培養(yǎng)皿用量60 g，PA6每培養(yǎng)皿30 g.

1.1.3 培養(yǎng)液

考慮到發(fā)菜生長(zhǎng)環(huán)境比較惡劣，并且自身具有固氮能力，選取BG110(不含氮)培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng).

1.2 方法

1.2.1 固體基質(zhì)接觸角的測(cè)試

潤(rùn)濕性是固體表面極為重要的性質(zhì)，所謂潤(rùn)濕性是指流體在固體表面擴(kuò)展或粘附的趨勢(shì)[4].固體表面的潤(rùn)濕性一般用表觀接觸角來(lái)衡量.

接觸角(Contact Angle，CA)測(cè)定在德國(guó)Dataphysics公司生產(chǎn)的OCA20光學(xué)視頻接觸角測(cè)量?jī)x上進(jìn)行，注射針中液體注射速度為0.5μL/s，注射體積為3.0～5.0μL.測(cè)定溫度在室溫下進(jìn)行，25 ℃，水為去離子水.

樣品制備：測(cè)試材料至少要提供1 cm2平面才能進(jìn)行測(cè)試.取相同來(lái)源的玻璃片一塊替代玻璃渣進(jìn)行接觸角測(cè)試，取相同來(lái)源的具有光滑平面的同一卵石塊替代沙粒測(cè)試接觸角，PA6用甲酸溶解少許涂在蒸發(fā)皿上制成薄膜，粘貼在玻璃片上進(jìn)行接觸角測(cè)試.樣品測(cè)試前均洗滌干凈無(wú)污染物.

1.2.2 發(fā)菜細(xì)胞的培養(yǎng)

將備用的發(fā)菜細(xì)胞洗滌、離心后，用BG110作培養(yǎng)液稀釋至一定濃度作為接種菌液.

(1)發(fā)菜細(xì)胞的液體培養(yǎng).取5 mL稀釋液分別滴加于小三角瓶中，并補(bǔ)加BG110培養(yǎng)液至15 mL.

(2)發(fā)菜細(xì)胞的固體培養(yǎng).取5 mL接種液分別滴加于粗砂、玻璃渣和PA6培養(yǎng)皿內(nèi)，并補(bǔ)加BG11培養(yǎng)液至15 mL.將液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)發(fā)菜加蓋置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為90μmol·m-2·s-1，光暗比為12∶12，溫度白天25 ℃，夜晚10 ℃.每2日補(bǔ)少量水于固體基質(zhì)材料，保持表面濕潤(rùn).

1.2.3 生物量的測(cè)定

采用葉綠素含量法，間接測(cè)定發(fā)菜細(xì)胞生物量[5]，藍(lán)細(xì)菌液中的葉綠素含量按下式計(jì)算[6]：Chla(μg/培養(yǎng)皿或三角瓶)=40×13.9×A665×V甲醇/V樣.

1.2.4 發(fā)菜多糖測(cè)定

將液培發(fā)菜直接過(guò)濾，分別收集濾液和發(fā)菜細(xì)胞；3種固培發(fā)菜均用蒸餾水將發(fā)菜細(xì)胞從固體基質(zhì)上清洗下來(lái)，清洗液直接過(guò)濾，分別收集3種濾液和發(fā)菜細(xì)胞.

分別將收集的4種發(fā)菜細(xì)胞干燥、粉碎后，取相同體積干粉M，用熱水浸提，收集濾液，濃縮，醇沉所得多糖為莢膜多糖；將收集的4種濾液分別濃縮、醇沉后所得多糖為胞外多糖.

分別將醇沉后的8種多糖熱水復(fù)溶后至相同體積V，透析，以苯酚-硫酸法[7]逐一測(cè)定其吸光度，以下式計(jì)算其多糖含量：發(fā)狀念珠藻多糖含量G(以葡萄糖計(jì)，mg/mL)=C×V×0.9.式中，C為標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液濃度；V為測(cè)得吸光度所對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的體積；0.9為校正系數(shù).

1.2.5 發(fā)菜蛋白質(zhì)的測(cè)定

分離發(fā)菜細(xì)胞，干燥粉碎后得發(fā)菜細(xì)胞干粉，稱取一定量的發(fā)菜干粉進(jìn)行蛋白測(cè)定.

總蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法：按GB/T5009.5-2003食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定[8]方法進(jìn)行操作.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1 不同固體基質(zhì)材料的接觸角

2.1 固體基質(zhì)材料的潤(rùn)濕性

所謂接觸角，是指液體在固體表面上形成液滴，達(dá)到平衡時(shí)，在氣、液、固3相交界處氣/液界面和固/液界面之間的夾角，用θ表示，液體在固體上的接觸角越小，潤(rùn)濕性能越好[9].由表1可以看出，所選定的3種固體基質(zhì)材料都具有親水性，潤(rùn)濕性大小依次是玻璃渣>沙粒>PA6，即玻璃渣的潤(rùn)濕性最好，沙粒次之，PA6最差.

2.2 不同培養(yǎng)條件下發(fā)菜細(xì)胞的生長(zhǎng)情況

不同培養(yǎng)條件下發(fā)菜細(xì)胞的生長(zhǎng)情況如圖1所示，發(fā)菜細(xì)胞在液體培養(yǎng)的條件下生長(zhǎng)速率最高，60 d增長(zhǎng)了177%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于所有固體培養(yǎng).在固體培養(yǎng)中，發(fā)菜細(xì)胞在粗沙固體基質(zhì)上的生長(zhǎng)速率最高，60 d增長(zhǎng)了136%；在PA6上次之，60 d為53%；在玻璃渣上最低，60 d為-73%，呈現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng).

圖1 不同培養(yǎng)條件下發(fā)菜細(xì)胞 生長(zhǎng)情況(60 d)

2.3 不同培養(yǎng)條件下發(fā)菜細(xì)胞多糖分泌情況

不同培養(yǎng)條件下發(fā)菜細(xì)胞多糖分泌情況如圖2所示：發(fā)菜細(xì)胞莢膜多糖在液培中分泌量最高，多糖提取率為5.5%，在粗沙上次之，為5.2%，在PA6上再次之，為3.9%，在玻璃渣上最低，為2.7%；發(fā)菜細(xì)胞胞外多糖的分泌情況與莢膜多糖分泌情況相反，在玻璃上最高，為4%，在PA6上次之，為1.6%，在粗沙上再次之，為0.79%，在液培中最低，為0.53%；在玻璃上培養(yǎng)的發(fā)菜細(xì)胞中多糖提取率最高，為6.7%，在液培中次之，為6.03%，在粗沙上再次之，為5.99%，在PA6上最低，為5.5%.

圖2 不同培養(yǎng)條件下發(fā)菜細(xì)胞多糖分泌情況(60 d)

圖3 不同培養(yǎng)條件下發(fā)菜細(xì)胞中蛋白質(zhì)的含量(60 d)

2.4 不同培養(yǎng)條件下發(fā)菜細(xì)胞蛋白質(zhì)的生成

發(fā)菜在不同培養(yǎng)條件下蛋白生成量如圖3所示: 發(fā)菜細(xì)胞中蛋白含量在液培條件下含量最高，要明顯高于其他所有固體培養(yǎng)，為38.7 g，在PA6上次之，為20.3 g，玻璃上再次之，為18.9 g, 粗沙上蛋白含量最少，為15.1 g.

3 討論

發(fā)狀念珠藻雖然分布于干旱、半干旱地區(qū)的部分荒漠草原和荒漠地帶，但其生長(zhǎng)也需要水，只是與其他生物相比承受缺水的能力更強(qiáng).在接種量、光照、溫度等生長(zhǎng)條件相同時(shí)，液體培養(yǎng)的發(fā)菜細(xì)胞由于水分充足其生長(zhǎng)速率高于固體培養(yǎng)，這說(shuō)明在今后的發(fā)狀念珠藻人工擴(kuò)大培養(yǎng)方面應(yīng)該更多地采用液態(tài)培養(yǎng)方式.采用液態(tài)培養(yǎng)能夠大規(guī)模、工業(yè)化培養(yǎng)發(fā)狀念珠藻，一方面可以獲得所需要的目的代謝產(chǎn)物(如發(fā)菜多糖、藻蛋白)滿足人類需要，另一方面可以獲得大量的發(fā)狀念珠藻種以進(jìn)行荒漠地帶的生態(tài)恢復(fù)和沙漠治理.發(fā)狀念珠藻在固體培養(yǎng)下，其對(duì)水分的需求具有干濕節(jié)律，發(fā)狀念珠藻從周圍吸收水分滿足生長(zhǎng)和生理活動(dòng)，但是在生理上水分過(guò)量會(huì)導(dǎo)致發(fā)狀念珠藻細(xì)胞損傷[10].在野生環(huán)境中，不斷供水反而引起發(fā)狀念珠藻的負(fù)增長(zhǎng)[11]，因此，在雨后迅速失水對(duì)發(fā)狀念珠藻是很重要的.發(fā)菜細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)缺水也很敏感[12]，輕度水分脅迫即引起細(xì)胞生長(zhǎng)減慢、細(xì)胞壁合成及蛋白質(zhì)合成的下降.玻璃渣固體基質(zhì)材料很高的潤(rùn)濕性可對(duì)發(fā)菜引起水分的過(guò)度供給，從而導(dǎo)致發(fā)狀念珠藻的負(fù)增長(zhǎng)；PA6固體基質(zhì)材料較弱的潤(rùn)濕性可對(duì)發(fā)菜細(xì)胞產(chǎn)生輕度水分脅迫，從而導(dǎo)致發(fā)狀念珠藻生長(zhǎng)緩慢，粗沙固體基質(zhì)材料適中的潤(rùn)濕性能提供較為合適的水分供給，因此發(fā)狀念珠藻生長(zhǎng)正常，保持了較好的生長(zhǎng)速率.在發(fā)狀念珠藻的固體培養(yǎng)中，發(fā)菜細(xì)胞生長(zhǎng)所依附的固體基質(zhì)表面性質(zhì)——潤(rùn)濕性也是一個(gè)需要考慮的重要影響因素.在今后的野外栽培中，也要把栽培環(huán)境的固體基質(zhì)潤(rùn)濕性作為一個(gè)因素考慮.

在不同的培養(yǎng)條件下，發(fā)菜細(xì)胞多糖分泌情況也有很大差異.發(fā)菜莢膜多糖的含量多少與發(fā)菜細(xì)胞的生長(zhǎng)情況密切相關(guān)，發(fā)菜細(xì)胞在液體培養(yǎng)條件下增長(zhǎng)最快，其中所含有的莢膜多糖也最多，接種在玻璃渣上的發(fā)菜細(xì)胞生長(zhǎng)呈衰弱趨勢(shì)，其莢膜多糖含量也最少.另一方面，發(fā)菜在生長(zhǎng)過(guò)程中也向細(xì)胞外分泌膠狀多糖物質(zhì)，成為胞外多糖，包裹于發(fā)狀念珠藻細(xì)胞及藻絲體外，可保護(hù)發(fā)菜細(xì)胞不受干旱、高溫、紫外輻射等不利環(huán)境的危害.胞外多糖作為細(xì)胞與環(huán)境直接接觸的橋梁，對(duì)發(fā)狀念珠藻在抵抗外界環(huán)境的脅迫方面具有重要的作用.發(fā)菜細(xì)胞在不利的生長(zhǎng)環(huán)境下因要克服不適條件，需要分泌更多的胞外多糖以保護(hù)自身不受傷害.在適合其生長(zhǎng)的液培條件下，胞外多糖的分泌量要少于固體培養(yǎng)的發(fā)菜細(xì)胞.固體基質(zhì)的潤(rùn)濕性同樣影響著胞外多糖的分泌，固體基質(zhì)潤(rùn)濕性過(guò)低，不利于發(fā)狀念珠藻獲取水分，發(fā)狀念珠藻就要分泌較多的胞外多糖，利用多糖具有的強(qiáng)親水性幫助其從環(huán)境中以較快的速度獲取水分；固體基質(zhì)潤(rùn)濕性很強(qiáng)，雖有利于發(fā)狀念珠藻從環(huán)境中獲取水分，不會(huì)受到干旱環(huán)境的脅迫，但由于固體水分過(guò)多也能阻礙發(fā)狀念珠藻生長(zhǎng)，發(fā)狀念珠藻分泌更多的胞外多糖保持水分的平衡供給.這說(shuō)明發(fā)狀念珠藻對(duì)不利的固體材料潤(rùn)濕性具有一定的自我調(diào)節(jié)機(jī)制，這種調(diào)節(jié)機(jī)制通過(guò)胞外多糖分泌量調(diào)整來(lái)完成，可見發(fā)菜細(xì)胞自身的生長(zhǎng)情況以及生長(zhǎng)環(huán)境都是影響發(fā)菜多糖含量的重要因素.陳雪峰[13]等初步研究了液培發(fā)菜莢膜多糖和胞外多糖的結(jié)構(gòu)特性與活性，發(fā)現(xiàn)其莢膜多糖及胞外多糖的結(jié)構(gòu)和活性均有較大差異，這為今后對(duì)固培發(fā)菜細(xì)胞中多糖的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ).

在不同的培養(yǎng)條件下，發(fā)菜細(xì)胞的良好生長(zhǎng)有利于發(fā)菜中蛋白質(zhì)的積累.在其他生長(zhǎng)條件相同時(shí)，水分充足的液體培養(yǎng)的發(fā)菜細(xì)胞中蛋白質(zhì)含量要明顯高于其他固體培養(yǎng)，這說(shuō)明發(fā)菜細(xì)胞也可作為藻蛋白的一種新來(lái)源，在今后發(fā)狀念珠藻蛋白質(zhì)的獲取上可以更多地采用液態(tài)培養(yǎng)方式.

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