5株無(wú)花果葉內(nèi)生真菌的分離鑒定和抗菌活性的研究

劉 瑞, 馬養(yǎng)民, 張弘弛

(1.山西大同大學(xué)農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院， 山西 大同 037009； 2.陜西科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

內(nèi)生真菌(endophytic fungi)是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官內(nèi)部的真菌，被感染的宿主植物不表現(xiàn)出外在病癥[1]，可通過(guò)組織學(xué)方法或從嚴(yán)格表面消毒的植物組織中分離，或從植物組織內(nèi)直接擴(kuò)增出微生物DNA的方法來(lái)證明其內(nèi)生.內(nèi)生真菌與宿主形成長(zhǎng)期的共生關(guān)系，代謝產(chǎn)物十分豐富，它是篩選新型抗生素和其它生理活性物質(zhì)的重要資源[2,3].

無(wú)花果(Ficuscarice)是?？坡淙~小喬木或灌木，成熟或近成熟的花序托內(nèi)藏花和瘦果，故名無(wú)花果.無(wú)花果營(yíng)養(yǎng)豐富，含有豐富的有機(jī)酸、氨基酸、糖類、維生素、果膠以及無(wú)花果元酶、微量元素等[4,5]，還有提高人體免疫力、延緩衰老和抑制多種癌細(xì)胞發(fā)生或發(fā)展的特殊功效.目前已經(jīng)從無(wú)花果中分離出13種抗癌活性成分，對(duì)治療多種癌癥有明顯效果[5].我們已從無(wú)花果中分離得到64株內(nèi)生真菌并進(jìn)行了初步篩選[6]，本文將對(duì)5株無(wú)花果葉高活性內(nèi)生真菌進(jìn)行進(jìn)一步研究，為開(kāi)發(fā)利用無(wú)花果內(nèi)生真菌資源提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

(1)植物材料及來(lái)源：無(wú)花果材料采自西北農(nóng)林科技大學(xué)西林苗圃.

(2)培養(yǎng)基：分離培養(yǎng)基為PDA固體培養(yǎng)基；發(fā)酵用培養(yǎng)基為察氏液體培養(yǎng)基；細(xì)菌指示菌培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；植物病原菌和酵母菌指示菌用PDA固體培養(yǎng)基.滅菌條件為121 ℃、30 min.

(3)指示菌株及來(lái)源：革蘭氏陽(yáng)性菌選用金色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)；革蘭氏陰性菌選用大腸桿菌(Escherichiacoli)；植物病原菌選用白菜黑斑病菌(Alternariabrassicae)、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)、蘋果腐爛病菌(Valsamali)、西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.niveum)、 煙草赤星病菌(Alternariaalternata)； 酵母菌用假絲酵母菌(Candiasp.)和紅酵母(Rhodotorulasp.).以上菌種由西北農(nóng)林科技大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供.

1.2 方法

(1)內(nèi)生真菌的分離純化：取健康無(wú)花果葉，用無(wú)菌水沖洗干凈，晾干水分后，用剪刀剪成0.5 cm×0.5 cm小塊，采用下述方法進(jìn)行表面消毒：75%乙醇消毒30 s，用3%次氯酸鈉消毒5 min，再用75%乙醇消毒1 min，無(wú)菌水沖洗2～3次.以上材料分別置于已倒好的PDA培養(yǎng)基上，放置在28 ℃培養(yǎng)3～7 d后，觀察皿中材料切口處長(zhǎng)出菌絲(菌落)，挑取植物組織周圍的菌落轉(zhuǎn)接入PDA斜面中，經(jīng)純化后即得內(nèi)生真菌，轉(zhuǎn)接至新PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)并對(duì)菌株進(jìn)行編號(hào)，保存.采用漂洗液檢驗(yàn)法[7]和組織印跡法[8]進(jìn)行滅菌效果的檢驗(yàn).

(2)內(nèi)生真菌的培養(yǎng)及發(fā)酵產(chǎn)物的提?。簩⒎蛛x的無(wú)花果葉內(nèi)生真菌，無(wú)菌接種于制備好的培養(yǎng)平板上，28 ℃，培養(yǎng)3 d后，無(wú)菌操作從培養(yǎng)平板取0.6 cm的內(nèi)生真菌菌餅，接種至含400 mL查氏液體培養(yǎng)基1 000 mL的錐形瓶中，于28 ℃，130 r/min搖床上振蕩培養(yǎng)12～15 d后從搖床中取出培養(yǎng)物，4層紗布過(guò)濾得菌絲和發(fā)酵濾液.發(fā)酵液用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯萃取液減壓濃縮后得到粗品代謝物，備用.菌絲于45 ℃烘干，研磨成粉，稱取各菌株菌絲0.1 g，用丙酮超聲萃取3次，萃取液減壓濃縮后得到粗品代謝物，備用.

(3)抑菌活性測(cè)試

測(cè)試培養(yǎng)基的制作：測(cè)試菌用5 mL無(wú)菌生理鹽水直接沖洗受試菌的斜面，搖勻后，滴一滴于血球計(jì)數(shù)器載玻片小室內(nèi)，蓋上蓋玻片(注意排除氣泡)，顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后稀釋到濃度為106個(gè)/mL的菌懸液.將1 mL菌懸液快速倒入40～50 ℃融化的9 mL培養(yǎng)基中，搖勻后迅速裝到培養(yǎng)皿中，冷卻后得到含有不同測(cè)試菌的培養(yǎng)基.

代謝產(chǎn)物抗菌活性篩選(濾紙片法)[9]：將1.2(1)中所得粗品代謝物分別配成10 mg/mL的丙酮溶液，然后取濾紙片(Φ=0.6 cm,已滅菌)浸沒(méi)于粗品丙酮溶液中，使其充分飽和，略微風(fēng)干后，接于含有測(cè)試菌的培養(yǎng)皿中，各內(nèi)生真菌的粗品代謝物對(duì)測(cè)試菌分別作3個(gè)重復(fù).以丙酮作為CK，將制好后的培養(yǎng)皿在28 ℃恒溫培養(yǎng)2～4 d后觀察，測(cè)其抑菌圈的大小.

(4)內(nèi)生真菌的鑒定：采用插片培養(yǎng)方法，對(duì)有高活性的無(wú)花果葉內(nèi)生真菌進(jìn)行分類鑒定，分類鑒定參照文獻(xiàn)[10，11].

2 結(jié)果與分析

2.1 表面消毒效果的檢查

經(jīng)漂洗液檢驗(yàn)法和組織印跡法的檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對(duì)照周圍無(wú)菌落出現(xiàn)，證明該樣品表面滅菌徹底，證明分離得到的無(wú)花果葉的內(nèi)生真菌真菌來(lái)源于植物組織內(nèi)部，而非植株表面附生菌或其它雜菌.

2.2 內(nèi)生真菌的分離結(jié)果及形態(tài)學(xué)特征

從無(wú)花果葉中分離到的5株內(nèi)生真菌經(jīng)顯微形態(tài)觀察，形態(tài)描述見(jiàn)表1，初步鑒定5株內(nèi)生真菌分別屬于1目，2科，3屬(見(jiàn)表2).

表1 5株無(wú)花果葉內(nèi)生真菌的菌落特征及細(xì)胞形態(tài)

表2 5株無(wú)花果葉內(nèi)生真菌鑒定結(jié)果

2.3 無(wú)花果葉內(nèi)生真菌菌絲丙酮提取物的抑制作用

生物活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(見(jiàn)表3)，5株無(wú)花果葉內(nèi)生真菌菌絲丙酮提取物具有廣譜抑菌性，從抑菌效果來(lái)看，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用效果最明顯(見(jiàn)圖1)，對(duì)煙草赤星病菌的抑制作用最低.從廣譜抑菌結(jié)果來(lái)看，抑菌效果最顯著的是編號(hào)為FL24和FL25兩株無(wú)花果內(nèi)生真菌，而且重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定.

表3 內(nèi)生真菌菌絲丙酮提取物的抑制效果

注：① F表示無(wú)花果，L表示葉部；②-：0<Φ(平均抑菌圈直徑) <6 mm； +：6 mm≤Φ<10 mm； ++：10 mm≤Φ<16 mm；+++：16 mm≤Φ<26 mm； ++++：Φ≥26 mm；③B1金色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，B2大腸桿菌(Escherichiacoli)，P1白菜黑斑病菌(Alternariabrassicae)，P2番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)，P3辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)，P4蘋果腐爛病菌(Valsamali)，P5西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.niveum)，P6煙草赤星病菌(Alternariaalternata)，Y1假絲酵母菌(Candiasp.)，Y2紅酵母(Rhodotorulasp.).

圖1 內(nèi)生真菌菌絲丙酮提取物的抑菌效果A，B為內(nèi)生真菌菌絲丙酮提取物分別對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈

2.4 無(wú)花果葉內(nèi)生真菌發(fā)酵液乙酸乙酯提取物的抑制作用

表4的結(jié)果表明，5株無(wú)花果葉內(nèi)生真菌發(fā)酵液乙酸乙酯提取物同樣具有廣譜抑菌性，對(duì)細(xì)菌和酵母菌表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制活性，某些菌種的發(fā)酵液乙酸乙酯提取物對(duì)植物病原菌表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制活性.綜合比較抑制效果，5株內(nèi)生真菌的發(fā)酵液抑菌活性明顯高于菌絲體丙酮提取液，由此可以確定，無(wú)花果葉內(nèi)生真菌的抑菌活性物質(zhì)主要富集在真菌發(fā)酵液中.

表4 內(nèi)生真菌發(fā)酵液乙酸乙酯提取物的抑制效果

注：① F表示無(wú)花果，L表示葉部；②-：0<Φ(平均抑菌圈直徑) <6 mm； +：6 mm≤Φ<10 mm； ++：10 mm≤Φ<16 mm；+++：16 mm≤Φ<26 mm； ++++：Φ≥26 mm；③B1金色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，B2大腸桿菌(Escherichiacoli)，P1白菜黑斑病菌(Alternariabrassicae)，P2番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)，P3辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)，P4蘋果腐爛病菌(Valsamali)，P5西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.niveum)，P6煙草赤星病菌(Alternariaalternata)，Y1假絲酵母菌(Candiasp.)，Y2紅酵母(Rhodotorulasp.).

抑菌效果最顯著的是編號(hào)為FL24的無(wú)花果葉內(nèi)生真菌，F(xiàn)L24菌株的發(fā)酵液活性成分對(duì)金黃色葡萄球菌和紅酵母的抑菌圈直徑可達(dá)34.7 mm和37.8 mm，對(duì)假絲酵母、辣椒疫霉菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑分別可達(dá)28.1 mm，26.4 mm和25.2 mm，而對(duì)白菜黑斑病菌、番茄灰霉病菌、蘋果腐爛病菌、煙草赤星病菌4種測(cè)試菌的抑菌圈直徑在16～24 mm范圍內(nèi)(見(jiàn)圖2)，表現(xiàn)出明顯的拮抗活性作用，而且重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定.

3 結(jié)論

(1)5株無(wú)花果葉內(nèi)生真菌中存在著具有高活性的抑菌活性物質(zhì)，經(jīng)形態(tài)學(xué)分類，這些真菌分布在3個(gè)屬的真菌分類類群中，說(shuō)明具有抗菌作用的內(nèi)生真菌的屬種分布具有多樣性.

(2)5株無(wú)花果葉內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物的抑菌效果非常好，具有廣譜抗菌性，其抑菌物質(zhì)主要富集于發(fā)酵液中.

(3)確定編號(hào)為FL24的菌種為目標(biāo)菌株，對(duì)其發(fā)酵液中的活性成分具有很強(qiáng)的抑菌活性，表現(xiàn)出具有一定的應(yīng)用潛力，為新型抗菌物質(zhì)的開(kāi)發(fā)提供了豐富的資源，因此有必要對(duì)其內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物進(jìn)行系統(tǒng)深入研究.

[1] Petrini O. Fungal endophytes of tree leave. In: Andrews J H, Hirano S S. Microbial Ecology of Leaves[M]. New York: Springer-Verlag,1991：179-197.

[2] 鄒文欣，譚仁祥.植物內(nèi)生菌研究新進(jìn)展[J].植物學(xué)報(bào)，2001,43(9)：881-892..

[3] 馬養(yǎng)民，馮成亮，植物內(nèi)生真菌抗腫瘤活性成分研究進(jìn)展[J]. 有機(jī)化學(xué)，2009，29(8): 1 182-1 191.

[4] 李彬成.無(wú)花果杏果抽提物抗癌療效顯著[J]. 國(guó)外科技，1987,(4)：32.

[5] 毛新偉，陳友地，楊 倫，等.無(wú)花果抗癌研究綜述[J]. 林產(chǎn)化工通訊，1998，(5)：13-15.

[6] 張弘弛，馬養(yǎng)民，劉 瑞，等，無(wú)花果內(nèi)生真菌的研究Ⅰ. 抗植物病原真菌活性的篩選[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2007 ,16 (2) :232-236.

[7] Mclnroy. Survey of indigenous bacterial endophytes from cotton and sweet corn[J]. Plant and Soil,1995,173:337-342.

[8] Sturz A V. Biodiversity of endophytic bacteria which colonize red clover nodules ,roots, stems and foliage and their influence on host growth[J]. Plant Pathology, 1997,48:360-369.

[9] 施巧琴，吳松剛.工業(yè)微生物育種學(xué)(第二版)[M].北京：科學(xué)出版社，2003：69-72.

[10] 魏景超.真菌鑒定手冊(cè)[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，1982：129-649.

[11] H.L巴尼特，B.B亨特著，沈崇堯譯.半知菌屬圖解[M].北京：科學(xué)出版社，1977:41-197.