仔豬致病性大腸桿菌的分離與鑒定

史麗華

(遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院,遼寧錦州 121001）

遼寧省義縣某養(yǎng)豬場飼養(yǎng)種豬200余頭,2006年3～4月間,部分10～20日齡仔豬發(fā)病,發(fā)病率50%～70%。經(jīng)臨床診斷為仔豬大腸桿菌病,我們對發(fā)病豬進(jìn)行了致病性大腸桿菌分離鑒定,對分離菌進(jìn)行了藥敏試驗(yàn),為防治該病提供依據(jù)。

1 材料

1.1 病料來源 共3株,分別從患病豬的直腸處取樣和病死豬的心血和肝臟中分離。

1.2 培養(yǎng)基及試劑 培養(yǎng)基、化學(xué)試劑及微量發(fā)酵管等,上海生物制品研究所生產(chǎn)。

1.3 試驗(yàn)動物 3周齡小鼠15只,購自遼寧醫(yī)學(xué)院動物房;仔豬由遼寧醫(yī)學(xué)院豬場提供。

1.4 定型血清 大腸桿菌O抗原單價(jià)血清,購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.5 藥敏紙片 藥敏紙片由上海市伊華有限公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 細(xì)菌分離 將病料分別接種麥康凱瓊脂平板,37℃培養(yǎng)18～24 h,觀察菌落形態(tài)。

2.2 純化培養(yǎng) 從麥康凱瓊脂平板上挑取單個(gè)紅色菌落接種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上,37℃培養(yǎng)18～24 h,然后移植于普通瓊脂平板上培養(yǎng)。

2.3 生化試驗(yàn) 取待檢菌純培養(yǎng)物分別接種在蛋白胨水、緩沖蛋白胨水、枸櫞酸鹽、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、尿素瓊脂、三糖鐵瓊脂(TSI）、

半固體瓊脂培養(yǎng)基上,置37℃恒溫箱中,培養(yǎng)18～24 h,觀察結(jié)果。

2.4 致病力測定

2.4.1 菌液制備 將分離并鑒定的3株大腸桿菌分別制成懸液(約3 050億個(gè)/m L）。

2.4.2 溶血性試驗(yàn) 將病原菌涂于血液瓊脂平板上,置37℃恒溫箱中培養(yǎng)18～24 h,觀察其溶血特性。

2.4.3 動物試驗(yàn) 小鼠試驗(yàn)前觀察3 d,確認(rèn)健康后用于試驗(yàn)。隨機(jī)分為3組,每組5只,兩組為試驗(yàn)組,另一組為對照組。試驗(yàn)組腹腔接種菌液,每只0.2 m L;對照組腹腔接種相同劑量的滅菌生理鹽水,隔離飼養(yǎng),觀察小鼠發(fā)病和致死情況,并對發(fā)病死亡小鼠進(jìn)行細(xì)菌分離和鑒定。

2.5 大腸桿菌O抗原血清型鑒定 將純培養(yǎng)物接種普通瓊脂平板上,37℃培養(yǎng)18～24 h,用無菌生理鹽水制成濃菌液,121℃高壓2 h,破壞其K抗原,進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)確定O血清型。先用微量滴管吸取抗血清于玻片上一小滴,再以等量各菌液加于血清中,即刻將兩者充分混勻,如0.5m in內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集者為陽性反應(yīng),同時(shí)以菌懸液與生理鹽水混合物作對照,觀察有無自凝集現(xiàn)象。

2.6 藥物敏感性試驗(yàn) 按K-B紙片擴(kuò)散法將被檢細(xì)菌涂布接種于普通瓊脂平板上,間隔一定距離貼上各種藥敏試紙,于37℃培養(yǎng)16～18 h后,觀察結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果 在普通瓊脂上長出中等大小、圓形、隆起、光滑、濕潤、半透明乳白色菌落;麥康凱瓊脂平板上長出中等大小紅色菌落,伊紅美藍(lán)瓊脂平板上長出紫黑色、帶金屬光澤的圓形菌落。

3.2 生化試驗(yàn)結(jié)果 見表1。

表1 分離菌株的生化特性

分離菌株生化試驗(yàn)結(jié)果顯示,能發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇。對蔗糖、多數(shù)不能發(fā)酵,少數(shù)發(fā)酵產(chǎn)酸。尿素酶試驗(yàn)陰性,不產(chǎn)生H2 S,有鞭毛,能運(yùn)動。符合大腸桿菌的生化特性,證實(shí)了分離菌株大腸桿菌的存在。

3.3 致病力測定

3.3.1 溶血性試驗(yàn) 被檢菌株均具有β溶血。

3.3.2 動物試驗(yàn) 接種6～10 h后,試驗(yàn)組小鼠全部發(fā)病,大部分小鼠出現(xiàn)拉稀,精神沉郁,低頭昏睡,呼吸加快,6只24 h內(nèi)死亡,4只36 h內(nèi)死亡。剖檢死亡小鼠可見肝臟腫大,有出血點(diǎn)和壞死點(diǎn);心包淤血;腸道嚴(yán)重臌脹,腸腔內(nèi)充滿水樣稀便。采取試驗(yàn)組小鼠的心血、肝和脾接種在普通瓊脂平板及普通肉湯,37℃培養(yǎng)20 h,有細(xì)菌生長。革蘭染色及生化鑒定表明此菌與接種細(xì)菌為同種細(xì)菌。表明該菌對小鼠具有較強(qiáng)的致病力。對照組飼養(yǎng)7 d后全部存活,剖檢未見病變。

3.4 大腸桿菌O抗原血清型鑒定結(jié)果 三個(gè)菌株均為O138。

3.5 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果 此次分離的大腸桿菌對阿米卡星、環(huán)丙沙星、氟苯尼考極度敏感;對慶大霉素、氨芐西林高度敏感;對諾氟沙星中度敏感;而新諾明、紅霉素、青霉素和頭孢唑啉鈉對分離菌完全沒有抑制作用。

4 小結(jié)與討論

4.1 本次試驗(yàn)經(jīng)病原分離鑒定為仔豬大腸桿菌病。分離得到的3株大腸桿菌毒力較強(qiáng),可使小鼠的發(fā)病率達(dá)100%,致死率100%。3株致病性強(qiáng)菌株均為O138。

4.2在藥物防治上,建議以藥敏試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)。在藥物治療的同時(shí),還應(yīng)注意配合補(bǔ)液、收斂等對癥療法以提高治療效果。該豬場在應(yīng)用了氟苯尼考治療后,有效地控制了該病的發(fā)展。