定量測定銅綠假單孢菌發(fā)酵液中鼠李糖脂的方法學(xué)研究

齊香君， 徐婷婷

(陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 前 言

本實(shí)驗(yàn)室為尋找高效的油脂降解菌，從餐廳油煙排出口附近篩選出一株油脂降解菌QZX-A，經(jīng)鑒定該菌株為銅綠假單胞菌.在對QZX-A菌株研究的過程中，涉及到定量測定鼠李糖脂的量[1].目前定量測定鼠李糖脂方法不一，且即使采用同一測定方法但最大吸收波長不一，推測可能是發(fā)酵液中的其他不明成分對測定鼠李糖脂造成了干擾.針對這一現(xiàn)狀，為了準(zhǔn)確測定發(fā)酵液中的鼠李糖脂，本研究采用蒽酮硫酸法定量測定發(fā)酵液中的鼠李糖脂[2]，系統(tǒng)地研究了反應(yīng)條件，并做了方法學(xué)考察.與其他蒽酮硫酸法不同的是，本研究在測定發(fā)酵液中的鼠李糖脂時(shí)采用的空白對照是未接種的發(fā)酵液，除了沒有接種，其他成分都與發(fā)酵液嚴(yán)格一致.

1 儀器與試藥

1.1 主要儀器設(shè)備

760CRT雙光束紫外可見分光光度計(jì)，752型紫外分光光度計(jì)，F(xiàn)A2004上皿電子天平.

1.2 主要試劑藥品

1.2.1 發(fā)酵液的制備

取銅綠假單胞菌QZX-B培養(yǎng)3 d的發(fā)酵液(培養(yǎng)基成分：KH2PO40.05%，K2HPO40.05%，(NH4)2SO40.1%，MgSO4·7H2O 0.01%，菜籽油1%，pH 8；培養(yǎng)條件：30 ℃，130 r/min，3 d).

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

稱取干燥恒重的鼠李糖對照品8.6 mg,用水溶解,定容于100 mL量瓶中,配制成0.086 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液.

1.2.3 蒽酮試劑的配制

取蒽酮0.20 g溶于100 mL 85%的硫酸中.

1.2.4 測定方法[3]

精確取標(biāo)準(zhǔn)品溶液或發(fā)酵液1.0 mL置于試管中,于冰水浴中加入0.2%的硫酸-蒽酮試劑4 mL,加完后混合均勻浸于沸水浴中, 15 min后取出,用自來水冷卻,室溫放置20 min.標(biāo)準(zhǔn)品溶液的空白以蒸餾水代替鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)品,發(fā)酵液的空白對照以未接種的培養(yǎng)基代替發(fā)酵液，進(jìn)行紫外檢測或者掃描.

2 研究內(nèi)容與方法

2.1 反應(yīng)條件研究

采用1.2.4中測定方法，研究該方法中的最大吸收波長、水解時(shí)間、水解溫度、蒽酮試劑加量、發(fā)酵液稀釋倍數(shù)等內(nèi)容.

2.2 方法學(xué)研究

采用2.1的研究結(jié)果，考察該方法的重復(fù)性、穩(wěn)定性、精密度、回收率.

3 結(jié)果與討論

3.1 實(shí)驗(yàn)條件的選擇

3.1.1 驗(yàn)證鼠李糖脂的存在

比較圖1和圖2可以明顯看出，圖2在620 nm處的特征峰高度在原有基礎(chǔ)上增加，峰形未發(fā)生變化，位置未發(fā)生偏移，因此可以確定發(fā)酵液中存在鼠李糖脂，且可以用測定鼠李糖的方法對鼠李糖脂定量檢測.

圖1 發(fā)酵液全波長掃描圖 圖2 發(fā)酵液添加鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)品后的全波長掃描圖

3.1.2最大吸收波長選擇

由圖3和圖4可知，標(biāo)準(zhǔn)品和發(fā)酵液的共有特征吸收峰在620 nm處重合，所以取620 nm為最大吸收波長.圖4采用未接種的發(fā)酵液作為空白對照，除了沒有接種，其他成分都與發(fā)酵液嚴(yán)格一致.

圖3 鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)品波長掃描圖 圖4 發(fā)酵液波長掃描圖

表1 不同水解時(shí)間的吸光度值(n=3),反應(yīng)溫度100 ℃

3.1.3 水解時(shí)間的選擇

由表1可以看出，水解15 min的吸光度值最大，說明鼠李糖脂此時(shí)水解程度最高，因此選15 min為最適水解時(shí)間.時(shí)間多于15 min溶液顏色由藍(lán)綠色變?yōu)樽丶t色，可能是水解時(shí)間過長，使發(fā)酵液中的其他成分發(fā)生了變化，影響顯色，導(dǎo)致數(shù)據(jù)不穩(wěn)定.

表2 不同水解溫度下的吸光度值(n=3)，水解15 min

3.1.4 水解溫度的選擇

由表2可知，水解溫度在80～100 ℃時(shí)吸光度值趨于穩(wěn)定，100 ℃時(shí)吸光度值最大，因此選取100 ℃為最適水解溫度.

3.1.5 蒽酮試劑加入量的選擇

蒽酮試劑加入量為1 mL，2 mL，3 mL時(shí)，因?yàn)榱蛩岜幌♂?，蒽酮析出，溶液渾濁?dǎo)致無法測量.加入量大于4 mL時(shí)，顏色偏黃棕色，可能是硫酸濃度過高，導(dǎo)致發(fā)酵液中其他成分碳化，影響檢測.經(jīng)紫外掃描，發(fā)現(xiàn)蒽酮加入量大于4 mL時(shí)，620 nm附近無特征吸收峰.因此選4 mL為最適加入量.

表3 不同蒽酮試劑加入量下的吸光度(n=3),水解時(shí)間15 min，反應(yīng)溫度100 ℃

3.1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[4]

圖5 鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL、8 mL、9 mL于10 mL容量瓶中，加蒸餾水定溶搖勻，再分別吸取各濃度鼠李糖溶液1 mL，加人4 mL蒽酮試液，于冰水浴中加入0.2%的硫酸-蒽酮試劑4 mL,加完后混合均勻浸于沸水浴中,自水浴重新煮沸起15 min后取出,用自來水冷卻,室溫放置20 min后以蒸餾水代替標(biāo)準(zhǔn)品溶液做對照，于620 nm處測定.

以鼠李糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，做回歸處理[5]，得回歸方程為y= 0.006x+0.003 3，相關(guān)系數(shù)R=0. 999 2,鼠李糖在濃度為8.6～60.2 mg/L范圍內(nèi)與吸光度值呈良好的線性關(guān)系.

3.1.7 發(fā)酵液樣品中鼠李糖含量的測定

精密吸取適當(dāng)稀釋倍數(shù)的發(fā)酵液1 mL，于冰水浴中加入0.2%的硫酸-蒽酮試劑4 mL,加完后混合均勻浸于沸水浴中,自水浴重新煮沸起15 min后取出,用自來水冷卻,室溫放置20 min后以未接種的發(fā)酵液做空白對照，于620 nm處測定.

表4 穩(wěn)定性測定數(shù)據(jù)(n=3)

該批發(fā)酵液鼠李糖脂的產(chǎn)量為1 057.75 mg/L.

3.2 方法學(xué)考察

3.2.1 穩(wěn)定性

取同一瓶樣品溶液，按3.1.8方法操作，放置顯色后每隔30 min測定1次,共測定5次，結(jié)果見表4，符合要求.

表5 重復(fù)性測定數(shù)據(jù)(n=3)

3.2.2 重復(fù)性

取同一批發(fā)酵液共5瓶，每瓶分別取樣稀釋，按3.1.8方法操作，測定其吸光度值，結(jié)果見表5，符合要求.

3.2.3 回收率試驗(yàn)

表6 回收率測定數(shù)據(jù)(n=3)

取已知濃度的樣品溶液5份，分別加入一定量的鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，測定吸光度值.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成鼠李糖的濃度，計(jì)算回收率，結(jié)果見表6.

加標(biāo)回收率達(dá)到99.98%，RSD=2.2%(n=5)，符合要求.

3.2.4 精密度

取同一瓶樣品溶液，按3.1.8方法操作，重復(fù)測定5次,結(jié)果見表7.RSD=0.1%，精密度符合要求.

4 結(jié)論

(1)蒽酮硫酸法測定發(fā)酵液中鼠李糖脂的條件為：精密吸取稀釋4倍的發(fā)酵液1 mL，于冰水浴中加入0.2%的硫酸-蒽酮試劑4 mL,加完后混合均勻浸于沸水浴中,自水浴重新煮沸起15 min后取出,用自來水冷卻,室溫放置20 min后以未接種的發(fā)酵液代替接種后的發(fā)酵液做空白對照，于620 nm處測定.

蒽酮硫酸法測發(fā)酵液中的鼠李糖脂，反應(yīng)條件與蒽酮硫酸法測糖的反應(yīng)條件相同.本研究的創(chuàng)新點(diǎn)在于采用未接種的空白培養(yǎng)基代替待測樣品中的發(fā)酵液作為空白，而不是采用蒸餾水做空白，優(yōu)點(diǎn)在于能夠消除其他物質(zhì)的干擾.

表7 精密度測定數(shù)據(jù)(n=3)

(2)方法學(xué)考察穩(wěn)定性、重復(fù)性、回收率、精密度合格.

(3)按照該方法測定發(fā)酵液中鼠李糖脂的量，得到的結(jié)果為1 057.75 mg/L.

因此采用本方法測定發(fā)酵液中鼠李糖脂，方法可靠可行.

參考文獻(xiàn)

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