咖啡因分子印跡聚合物微球的懸浮聚合法制備及吸附性能研究

董 雁，李兆峰

（龍巖學院 化學與材料學院，福建 龍巖 364012）

分子印跡技術(MIT)基本原理是在一定的溶劑中加入印跡分子和功能單體，兩者之間形成復合物，然后加入交聯(lián)劑使其形成分子印跡聚合物（MIP），最后洗脫掉印跡分子。自二十世紀80年代提出分子印跡技術與分子印跡聚合物的概念后，這項技術逐漸被人們熟知。由于分子印跡技術可以有效地對于目標分子進行識別、檢測、分析、分離等工作[1-4]。因此該技術具有很寬的應用范圍，在環(huán)境、醫(yī)藥、食品、軍事等方面，都有良好的應用前景。

咖啡因（化學名1,3,7－三甲基黃嘌呤或3,7－二氫－1,3,7三甲基－1H－嘌呤－2,6－二酮）是一種生物堿，從茶葉、咖啡果中提煉出來的，適量使用具有祛除疲勞、使神經(jīng)興奮的作用，臨床上用于治療昏迷復蘇和神經(jīng)衰弱。但是，大劑量或長期使用也會對人體造成損害，且有成癮性，因此被列入受國家管制的精神藥品范圍。建立一種快速高效測定咖啡因含量檢測方法具有重要意義。制備咖啡因及其類似結構印跡微球聚合物已經(jīng)有報道，但多數(shù)采用沉淀聚合法[5－8]。本文采用懸浮聚合法在水環(huán)境中制備對咖啡因具有識別功能的印跡聚合物微球。

1 實驗

1.1 主要儀器和試劑

1.1.1 儀器

TU－1901型雙光束紫外可見分光光度計 （北京普析通用儀器有限責任公司）；S－3400N鎢燈絲掃描電子顯微鏡（日本日立公司）；IS10傅立葉紅外光譜儀（Thermo Fisher Scientific）；STA－449F3同步熱分析儀（德國耐馳公司）。

1.1.2 試劑

咖啡因（CP）；聚乙烯醇（AR，PVA）；α－甲基丙烯酸（AR，MAA）；乙二醇二甲基丙烯酸酯（AR，EDGMA)；偶氮二異丁腈（AR，AIBN）；丙烯酰胺（AR，MA）；三氯甲烷（AR）。

1.2 實驗方法

1.2.1 印跡聚合物微球的制備

咖啡因分子印跡微球的制備：稱取一定量的PVA，在90～95℃的溫度下將其溶解到150 mL蒸餾水中，倒入150 mL三口燒瓶中冷卻至室溫后按一定的配方加入咖啡因三氯甲烷溶液、功能單體、交聯(lián)劑EDGMA、引發(fā)劑AIBN，然后在室溫下超聲脫氣30 min，在氮氣保護下60℃反應24 h，所得印跡聚合物微球用蒸餾水洗滌至紫外可見分光光度計檢測不出模板分子為止，將所得聚合物微球抽濾、干燥保存?zhèn)溆?。非印跡聚合物（NIP）的制備除不加模板分子，其余步驟同上。配方和用量見表1～表 4。

表1 不同功能單體的聚合物的配方和用量

表2 不同的模板分子與功能單體比例的聚合物的配方和用量

表3 不同的模板分子與交聯(lián)劑比例的聚合物的配方和用量

表4 不同反應時間的聚合物的配方和用量

1.2.2 印跡聚合物微球的吸附性能的測定

配置濃度為0.5 g/L的咖啡因標準水溶液，取25 mL標準水溶液至于標有0到21號的25 mL容量瓶中，稱取干燥的各組印記聚合物微球0.1 g加入到對應標號的容量瓶中，振蕩放置24 h，然后用紫外可見分光光度計在272 nm下測定吸附后溶液的吸光度值，根據(jù)標準溶液中咖啡因濃度的變化得出印跡微球的相對吸附量Q。

式中C0為咖啡因標準水溶液的初始濃度，單位為μg/L；C為吸附后母液中咖啡因的濃度，單位為μg/L；V0為咖啡因標準水溶液的體積，單位為L；m為參加吸附的聚合物的質量，單位為g。

用上述方法測定NIP的相對吸附量。

1.2.3 印跡聚合物的吸附速率

取若干份5.0 mL標準溶液，分別加入0.1 g聚合物后封口，每4h測一份，計算相對吸附量，平行測定3次取平均值。

1.2.4 印跡聚合物微球的掃描電鏡分析

真空中用離子濺射器對微球樣品進行噴金，后用SEM對聚合物微球進行掃描，觀測微球的表觀形貌。

2 結果與討論

2.1 功能單體的選擇

分別以MA、MAA為功能單體，在60℃下聚合反應所制得的微球的產(chǎn)量與吸附量如表5所示。

由表5可知，從聚合物產(chǎn)量考慮：以MA為功能單體時的產(chǎn)量較用MAA為功能單體時的產(chǎn)量低，可能是由于PVA和水與MA之間形成氫鍵的能力太強，降低了分散劑的作用，導致產(chǎn)量比較低；從吸附量考慮：以MAA為功能單體時所制得的聚合物微球的吸附量比較高，是因為MA與模板分子咖啡因形成的氫鍵作用比較強，不利于咖啡因的洗脫，從而影響了聚合物微球的吸附量。而不加模板分子咖啡因的空白聚合物對咖啡因也有一定的吸附作用，這可能是部分位于聚合物表面的單體與咖啡因產(chǎn)生了氫鍵作用的結果，屬于非特異性吸附。因此后續(xù)實驗選取MAA為功能單體。

表5 印跡聚合物微球的產(chǎn)量及其吸附量

2.2 模板分子與功能單體的不同比例

在60℃下，不同的咖啡因與MAA的比例混合反應24 h，制得的印跡聚合物微球對咖啡因分子的吸附量Q，結果如表6所示。

從表6可知，隨著功能單體用量的增加，吸附量呈現(xiàn)出由小變大再變小的趨勢。這可能是因為單體用量較少時，咖啡因分子會兩三個甚至更多個一組聚集在一起，在印跡聚合物微球表面形成較大的空穴，在與咖啡因分子識別過程中的結合作用微弱，不能有效的與咖啡因分子結合，影響聚合物的吸附量；當功能單體所占的比例增加時，吸附量也增大，當達到模板分子與功能單體間最佳比例n(咖啡因)∶n(MAA)為1∶4時，在該比例下，反應液中咖啡因分子恰好單個分子且能夠比較密集的鑲嵌在印跡聚合物微球表面并獲取預定的取向和定位，在與咖啡因分子識別過程中表現(xiàn)出較強的結合力，能有效捕獲咖啡因分子；吸附量也達到最大值，而隨著功能單體比例繼續(xù)增大，過量的MAA將部分咖啡因分子包在微球內(nèi)部較難洗脫，聚合物微球的吸附量反而降低了[9]。

表6 不同模板分子與功能單體比例下印跡微球的相對吸附量

2.3 模板分子與交聯(lián)劑的不同比例

60℃下，不同的咖啡因與EDGMA的比例混合反應24 h所制得的印跡聚合物微球的吸附量如表7所示。

從表7中可知，隨著交聯(lián)劑用量的增加，聚合物吸附量有著一個從小變大再變小的過程，在 n(咖啡因)∶n(EDGMA)=1∶20時，吸附量達到最大值。如果交聯(lián)劑量太少，使得MIP不具有足夠的交聯(lián)度，形成的印跡“記憶”空穴結構不完善，分子印跡聚合物機械強度和化學穩(wěn)定性較差，洗脫過程中模板分子留下的空穴容易被破壞，識別性能和結合強度下降，降低了MIP的吸附量；而交聯(lián)劑如果太多，導致過交聯(lián)度，使形成的印跡“記憶”空穴結構過于緊密，造成模板分子洗脫困難，MIP的吸附量也會降低。只有在最佳比例下，即模板分子與交聯(lián)劑物質的量之比為1∶20，此時制得的印跡聚合物微球具有恰好足夠的交聯(lián)度，形成最適合的識別咖啡因分子的空穴結構以捕捉咖啡因分子，印跡聚合物微球具有最理想的吸附量。

表7 不同模板分子與交聯(lián)劑比例下印跡微球的相對吸附量

2.4 反應時間

優(yōu)化實驗的反應時間（15-21號），找到一種最合適的反應時間，提高實驗效率，計算在不同時間下制得的MIP的質量和吸附量，將不同反應時間條件下制得的MIP的質量和吸附量隨時間的變化分別作圖，如圖1～圖2所示。

由圖1～圖2可知，聚合物的產(chǎn)量和吸附量都隨著聚合反應時間的增加而增大，但是在24 h時，產(chǎn)量和吸附量基本是達到了最大值，之后便不在隨聚合反應時間的加長而增大。這可能是因為在反應時間較短時，聚合反應進程還在持續(xù)，隨著微球數(shù)量在增多，微球表面還在繼續(xù)形成有“記憶”的空穴，微球的產(chǎn)量和吸附量也就隨著時間的加長而增多；當反應時間達到24 h時，基本完成了反應，微球表面的“記憶”空穴也不再增多，24 h后產(chǎn)量和吸附量保持穩(wěn)定，而且產(chǎn)量和吸附量差不多是同步的增長。

圖1 不同反應時間條件下制得的MIP的產(chǎn)量隨時間的變化關系

圖2 不同反應時間條件下制得的MIP的吸附量隨時間的變化關系

2.5 吸附速率的研究

測定所制備MIP在不同濃度咖啡因標準水溶液中吸附量隨時間的變化曲線，如圖3所示。

由圖3可知，在吸附初始階段淺孔對咖啡因分子的結合速率較快，但是，當淺孔被吸附飽和后，咖啡因分子向印跡微球的深孔傳質有一定的位阻，導致結合速率下降，在20h內(nèi)基本完成對咖啡因的吸附。

2.6 印跡微球的表觀形貌

由圖4可以看出，在放大500倍的下，聚合物呈現(xiàn)為微球形態(tài)，且粒徑均勻。

圖3 MIP的吸附速率

圖4 印跡聚合物微球掃描圖

2.7 MIP的Scatchard分析

通過采用靜態(tài)吸附法，測定以不同單體制成的印跡聚合物對咖啡因的結合等溫線如圖5所示。對獲得的數(shù)據(jù)進行Scatchard分析用以評價聚合物的結合特性。Scatchard方程為

式中Kd(mmol/L)是結合位點的平衡離解常數(shù)；Qmax（μmol·g-1）是結合位點的最大表觀結合量；C(咖啡因，μmol·L-1)表示聚合物達到平衡時上清液中的平衡濃度。以Q/C對Q作圖，得到MIP的Scatchard曲線見圖6。

圖5 MIP的結合等溫線

圖6 印跡聚合物的Scatchard曲線

由圖 6 可知， 吸附量 Q 分別在 0～4.9423 μmol·g-1和在 4.9423～8.0991 μmol·g-1這兩個范圍內(nèi)與Q/C呈線性關系，擬合可得到兩個線性部分的擬合線性回歸方程：y=19.47794-3.28676x，相關系數(shù)R=0.9985；y=5.29462-0.37737x，相關系數(shù)R=0.9869。由線性回歸方程的斜率k和截距可以計算出高親和位點的離解常數(shù)為Kd1=0.3043 mmol/L，最大表觀結合量Qmax1=5.9262 μmol/g；低親和位點的離解常數(shù)Kd2=2.6499 mmol/L，最大表觀結合量Qmax2=14.0322 μmol/g。這表明在所研究的濃度范圍內(nèi)，印跡聚合物微球MIP對咖啡因存在有兩類不等價的結合位點，具有非均一性[10]，表明咖啡因分子印跡聚合物微球對咖啡因具有良好的再結合能力?？赡苁且驗榭Х纫蚍肿咏Y構中存在有酰胺基和氨基兩種不同類型的功能基，均能與功能單體中的功能基（-NH，-OH）起作用，模板分子與功能單體預組裝時存在著兩種方式，可以形成兩種不同組成的配合物，經(jīng)交聯(lián)后在聚合物中形成兩種具有不同性質的作用位點。

3 結論

采用懸浮聚合法，在水溶液中合成對咖啡因具有選擇吸附性的分子印跡聚合物微球，用紫外可見光分光光度計對印跡聚合物微球的吸附性能進行研究，結果表明，以α-甲基丙烯酸為功能單體合成的分子印跡聚合物微球的吸附性能較好，最大表觀結合量可達14.0322 μmol/g。優(yōu)化反應條件得出最佳的工藝條件為：模板分子、功能單體和交聯(lián)劑的物質的量之比為1∶4∶20，反應時間為24 h。

［1］賴源發(fā)，張桂鳳，游勇基.分子印跡技術原理及其在藥物分析檢測中的應用［J］.海峽藥學，2009，21（6）： 4－8.

［2］GUAN G J，LIU B H，WANG Z Y ，et al.Imprinting of molecular recognition sites on nanostruc－tures and its applications in chemosensors ［J］.Sensors，2008，8（12）： 8291－8320.

［3］LEONHARDT A，MOSBACH K.Enzyme－mimicking polymer exhibiting specific substrate binding and cataly－ticfunctions［J］.React Polym，1987，6（3） ： 285－290.

［4］MARRIA KEMPE，KLAUS MOSBACH.Separation of animo acids，peptides and proteins on molecularly imprinted stationary phases［J］.J Chromatogrphy，1995，691 （2） ： 317－323.

［5］梁哲，莊瓊紅，姚傳義.沉淀聚合法制備1－苯丙醇印跡聚合物微球的研究［J］.廈門大學學報：自然科學版，2007，46（2）： 204－208.

［6］蔣紅旭，吳嫦秋，劉展眉.茶堿分子印跡聚合物微球的合成及其性能研究［J］.中草藥， 2013，44（15）： 2055－2058.

［7］王誠剛.咖啡因分子印跡的制備及其性能研究［J］.廣州化工，2009，37（8）： 138－139.

［8］姚偉，高志賢，房彥軍，等.沉淀聚合法制備咖啡因分子印跡聚合物微球［J］.化工進展， 2007，26（6）： 869－877.

［9］韓永萍，林強，王昶.懸浮法制備豆甾醇分子印跡聚合物微球［J］.應用化學，2008，25（5）： 556－559.

［10］李保利，張敏，姜萍，等.表面接枝分子印跡聚合物微球的合成及評價［J］.化學學報， 2007，65（10）： 955－961.